【2017年整理】ChIP 原理及实验方法.docxVIP

染色质免疫沉淀技术（ChIP）实验方法实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。仪器和试剂真空设备、涡旋器、液氮、冷冻离心管、离心机、超声波粉碎仪、miracloth37%甲醛，2M甘氨酸，ddH2O，剪切的鲑精DNA/protein A琼脂糖珠(Sant cruz)，蛋白酶K（14mg/ml）,RNaseA,酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,氯仿,无水乙醇,提取缓冲液1（EB1）:0.4M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（aprotinin、pepstain A、Leupeptin、Antipain、TPCK、Benzamidine）提取缓冲液2（EB2）:0.25M 蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；10mM MgCl2；1%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；5mM β-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）提取缓冲液3（EB3）：1.7M蔗糖；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.15%Triton X-100；2mM MgCl2；5mMβ-ME；0.1mM PMSF；蛋白酶抑制剂混合物（同上）核裂解缓冲液（NLB）：50mM Tris-HCl，pH8.0；10mM EDTA；1%SDS；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上）ChIP稀释缓冲液（ChIP DB）：1.1%Triton X-100；1.2mM EDTA；16.7 mM Tris-HCl，pH8.0；167mM NaCl；PMSF和蛋白酶抑制剂混合物（同上洗脱缓冲液（EB）：1%SDS；0.1M NaHCO3（现配）低盐洗脱液：150mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0高盐洗脱液：500mM NaCl；0.1%SDS；1%Triton X-100；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0LiCl洗脱液：0.25M LiCl；1%NP-40；1%脱氧胆酸钠；2mM EDTA；20mM Tris-HCl，pH8.0TE缓冲液：1mM EDTA；10mM Tris-HCl，pH8.0实验方法植物材料的准备（以拟南芥为例）1．在覆盖有保鲜膜的土里播上拟南芥的种子。2．约3周后，在50ml管中收集1.5g的幼苗，无菌水洗2次。甲醛固定4．室温下把幼苗浸在37ml 含1%的甲醛的EB1液中，抽真空10min。5．加入2M甘氨酸使终浓度至0.125M，中止反应，继续抽真空5min，此时幼苗应该变为半透明。(加2M甘氨酸约2.5ml)6．用40ml水洗幼苗3-4遍。7．去除幼苗水分，将幼苗液氮冷冻-80℃保存或继续进行下面操作。分离和超声染色质（注：除特殊注明，所有操作都在4℃进行）8．液氮预冷研钵和杵子，液氮研磨幼苗成粉末状。9．在50ml管中加入30ml EB1悬浮组织。(此时，EB1中不含甲醛)10．4层miracloth过滤组织到一个新的50ml管中。11．4℃，2880g离心20min。12．小心去上清，1ml EB2重悬沉淀。13．转移至一个新的1.5ml离心管。14．4℃，12000g离心10min。15．300ul EB3重悬沉淀。16．转入另一已加入300ul EB3新管中。17．4℃，16000g离心1小时。18．去上清，300ul NLB重悬沉淀（4℃操作），涡旋，用枪头吹打，保留10ul溶液做后续检测。（在上胶前，该溶液按下面DNA解交联的操作步骤一样）19．超声波处理溶液，打断DNA成约0.5-2kb的DNA片段。打断的染色质可以-80℃保存，或进行后续操作。免疫沉淀20．4℃，16000g离心5min沉淀碎片。21．转移上清到一个新管。保留10ul溶液去检测超声效率（按第35步往后处理）做后续检测 (以第18步保留的溶液做对照，电泳检测DNA片段的长度)。22．分200ul到2个新管，每管100ul。23．每管加900ul ChIP稀释液，使SDS浓度变为0.1%SDS。24．每个样品加4—40ul剪切的鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠（用前，珠必须洗3次，然后重悬于ChIP稀释液中），4℃，轻轻晃动1小时。（注：鲑精DNA /蛋白A琼脂糖珠的用量