【2017年整理】BrdU掺入实验.docVIP

BrdU掺入实验： 注释：溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU与胸腺嘧啶竞争掺入的强度可能与细胞增殖异常有关，如肝癌细胞约11.6%的胸腺嘧啶被替代，而正常肝细胞仅有1.1%。既往在分子遗传学等研究中常采用同位素标记，但有放射污染，技术难度大，实验周期长等缺点。近年来非放射性标记物的研究发展迅速，然而其敏感性多数不及同位素，使实验应用受限。自82年Gratzer制备出抗BrdU单抗及标记检测技术不断改良提高，应用BrdU标记的敏感性已与氘胸腺嘧啶核苷相似。目前认为BrdU是最有希望取代同位素的非放射性标记物之一。本文综述近年来BrdU研究概况，重点介绍标记过程中有关技术问题一、标记技术：1、剂量和途径：BrdU可用于体内或体外标记，体内标记时，实验鼠按体重60mg-200mg/kg于鼠腹膜射，狗按体重100mg/kg静脉注射，人体以表面积150μg/m2用量，取标本前8.25-10h静脉注射，免疫组化检测。BrdU经静脉给药一般无副作用，偶有道过量可致细胞突变。体外标记的研究广泛而深入，通常将保存在培养液中的新鲜组织剪啐至1-2mm3大小，离心去除了上清液后，加入100μg/mlBrdU，或新鲜组织在0.3mg/ml浓度的BrdU中37摄氏度1小时，然后固定包埋，细胞标记在RPMI1640-10培养液中进行，细胞数低于1×106/ml，加入20μl的BrdU孵育20 2、标本处理：适当的标本处理对BrdU染色强度至关重要。Meyer对450例乳腺癌组织体外标记总结出3点经验：切组织块＜1mm厚；固定前组织有代谢活力；封闭脱氧胸腺核苷合成酶，因此酶能使脱氧尿苷转变成脱氧胸苷，从而阻止内源性脱氧胸苷与BrdU竞争掺入DNA。Xiang最近回顾大量文献。广泛讨论固定包埋方法后，制备狗胫骨骨折模型，设3组对照研究，结果证实70%乙醇固定，epon包埋未脱钙狗骨组织的BrdU染色效果最好。Swales和Smith用BrdU单抗在超微水平研究昆虫血脑屏障，重点探讨标记过程对细胞超微结构特征的影响。比较4种固定后得出如下结论：单用多聚甲醛固定可获得良好的标记效果，但细胞结构易损伤，可加入单节显性戊二醛联合固定；等渗缓冲液加蔗糖磷酸/盐酸缓血酸胺缓冲剂或PBS对保持细胞结构有较好效果；用脱氧胆酸处理可增加标记，促进抗体联接，该项研究清楚显示线粒体，高尔基体、内质网等结果器。也有人建议如预备蛋白酶消化时，可用甲醛固定，而不用Carnoy或乙醇。 3、DNA变性BrdU掺入单链DNA碱基序列须经酸、碱、酶或加热等打开DNA双螺旋结构中的氢键，离子键和碱基推积力使DNA双链分离单链。DNA变性方式及程度直接影响标记效果，Williamson等回顾123份关于结直肠癌的告，发现用酸变性约占80%，在0.05-3.00MHCL间设9个浓度比较分析，对每种浓度作用的组织切片分别数5×103个细胞，结果冰冻切片＜0.01MhCL浓度变性后标记指数最高。低浓度酸产生高LI的原因可能DNA双链失稳态，组胺蛋白离解产生易使抗原掺入的SSSN段，另有人提出用低浓度酸从DNA离解出组胺蛋白后加热变性，可避免组胺产生稳定DNA低抗热变性的作用。消除组胺可降低原位DNA的熔解温度阈，酸预处理使染色质核小体结构几乎全部破坏，从而使DNA解螺旋更广泛。坚持热变性者认为加热较酸对BrdU掺入能提供更多结合部位。此外，变性和单抗孵育须严格衔接，如变性后BU20a单抗孵育延误1小时，BrdU阳性细胞核标记数便从6.6%降至1.4%，说明影响LI的因素复杂，加单抗前仔细研究变性技术及干扰因素，从而获得BrdU标记应有的高LI是必要的。另外采作BrdU标记核酸分子可能对DNA变性有非凡要求，需进一步探索。 4、标记染色：如何延长BrdU作用时间以标记新进入S期的细胞。使增殖缓慢的细胞标记率提高，是另一个重要问题，早年有人用恒定套管装置和非生物降解弹丸对大鼠研究，但结果重复性差。近来Maysinger研制一种具有很好的生物相容性可降解的微囊用于体内、外标记，通过电镜、影像技术及免疫细胞化学分析，证实微囊中BrdU能有效掺入鼠脑疾患四周的增生细胞核中，可连续释放高浓度BrdU达48-50小时。另有人研究渗透性微囊和缓弹丸，发现标记效果均优于单次注射。研究非放射性标记物常与放射性标记物相比，以证实特异性，敏感性及其它有关特性，在同一靶细胞比较似乎更具有说服力。然而3H-TdR和BrdU的比标记研究不能在同一时间给药，因两种标记物在同一个细胞增殖周期内竞争胸腺嘧啶激酶。有人认