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植物细胞编程死亡及其与发育的关系 苏州科技学院，1020212212，张言光 摘 要 细胞编程死亡是细胞分化的最后阶段，在植物发育过程中像细胞分裂一样是必不可少的，没有细胞分裂就不肯能形成植物体，没有细胞的编程死亡也同样不能建成植物体。 关键词 死亡、程序 、形态学特征 一PCD概念 PCD的概念首先是由Gluchsmanzai 1951年提出，他认为在生物体发育过程中普遍存在这一类在发育的特定阶段发生细胞死亡的现象。1972年Kerr等将生理刺激下细胞的特殊死亡命名为“凋亡”，指在生物体发育过程中普遍存在的不同于细胞坏死的特殊死亡形式，是外界环境因素诱导启动了细胞内业已存在的由基因编码的“死亡程序”而导致的细胞死亡。这方面的研究最在是从形态学开始的，随后引起了生理学，生物化学和分子生物学领域的科研人员的广泛注意，是这一研究被推向了高潮，并已成为细胞生物学研究中的热点之一。 二PCD的特征及其与坏死的比较 Kerr等细胞的死亡分为两类，一为编程死亡，一为坏死。因为他们是做解剖学和植物学研究的，所以就将编程死亡称之为凋亡。从形态学上看，这些细胞首先被分割成一块块，然后被巨噬细胞吞噬，最后全部死亡，就像秋天树叶的凋落一样。在凋亡过程中，首先是核发生很大变化，染色质浓缩分离，趋近核膜；随后细胞之也浓缩，细胞核变形，细胞骨架折叠，核膜断裂，并随之（几分钟后）又分成许多小块，同时细胞质向外出芽，形成小泡，然后形成了膜包围的凋亡小体，最后被周围细胞吸收，这些步骤的时序性很强，因此凋亡是指PCD的形态学特征。而坏死则是核和细胞膜都坏死，没有时序性，最后整个细胞破裂而死。 PCD的最明显的特征就是caspase（半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶）的出现和DNA的降解。在大多数细胞凋亡类型中，DNA的段裂分为两个阶段。第一阶段，染色质DNA被段裂成Mf较大的染色质DNA片段；第二阶段，断裂的染色质DNA被依赖于Ca2+、Mg2+的DNA酶Ⅰ（DNase Ⅰ）进一步内切成180~200bp及其不同倍数的片段。有的研究发现在PCD中有生物大分子的合成，因为这一过程可被放线菌素D抑制，因此可能有新蛋白的合成。但也有的人提出，是一些蛋白质由非活性状态或抑制状态转变成活性状态。因此，细胞中的离子也发生变化，特别是Ca2+，如果细胞内Ca2+增加，打开了Ca2+通道，就开始了凋亡过程，但有体系中没有发现这种变化。而Zn2+是核酸酶的抑制剂，所以他能阻止凋亡过程。细胞骨架的变化是PCD的又一特征，有人发现，去掉微管可导致凋亡，而微丝对凋亡是必需的。根据对动物和植物PCD的研究一般PCD最明显的形态学变化是核内染色质浓缩并呈边缘化，DNA降解成寡聚核苷酸片段，这与某些特异蛋白的表达有关。细胞一旦进入编程死亡，通常要经过以下过程：（1）染色质浓缩前阶段，此阶段长短不一，无形态学变化，谷氨酰胺转移酶合成增加，某些蛋白酶被激活；（2）染色质开始浓缩，并分布在核膜周围（边缘化），一些依赖于Ca2+、Mg2+的核酸内切酶被激活，使染色质DNA断裂成片段；（3）细胞质浓缩，桥粒于中间纤维的连接被破坏细胞膜形成泡膜，膜中蛋白质的组成发生很大变化；（4）膜泡形成凋亡小体，并通过特异识别蛋白被周围细胞或巨噬细胞吞噬，然后被溶酶体分解。 三检测PCD的方法 （1）细胞形态学变化 当细胞发生编程死亡时，如果用DNA结合的荧光染料DAPI染色，在荧光显微镜下可看到细胞核的凝聚固缩用其他核燃料也可得到类似效果。在电镜下可看到发生PCD的细胞典型超微结构：体积减小，细胞核染色质凝集并呈趋边化，后期核膜破裂：细胞质染色逐步加深，内膜系统紊乱，也泡沫崩溃，细胞器退化不可辨认，出现许多不同大小核电子致密的球状物 （2）总DNA凝胶电泳 用欲检测物为材料按常规方法提取总DNA，置于含溴化乙锭（EB）的1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，如果发生了PCD，则出现典型的梯装条带，如果发生坏死，则呈模糊的弥散状条带。不过应当指出的是，除少数由真菌引起的外，以前检测的植物PCD的植物细胞中都较难得到DNA ladder。 （3）原位末段标记法（TUNEL 检测） 用常规石蜡切片即可进行，其原理是核DNA断裂后产生3’-羟基末端，DNA聚合酶Ⅰ可将Siotin-11+dUTP标记到3’-羟基末端上，该生物素通过与亲和素的特异性结合使HRP-Avidin(辣根过氧化物酶标记的亲和素)结合在DNA断点部位，加入DAB显色液后，在原位出现黄褐色沉淀。 （4）流式细胞计数法 此项技术是根据发生在PCD细胞的DNA发生断裂和丢失，用碘化丙锭是DNA产生激发荧光，通过流式细胞仪检出发生PCD的亚二倍细胞同时又可观察细胞周期状态。 （5）彗星电泳 彗星电泳是将单个细胞悬浮于琼脂糖中，经裂解处理后，在电场中进行短时间电泳，