核算杂交技术,聚合酶链反应描述.ppt

核算杂交技术 概述 分子生物学的重要方法之一 使用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法 基本原理 核酸 由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA；和脱氧核糖核酸，简称DNA。DNA是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，RNA在蛋白质合成过程中起着重要作用，其中转移核糖核酸，简称tRNA，起着携带和转移活化氨基酸的作用；信使核糖核酸，简称mRNA，是合成蛋白质的模板；核糖体的核糖核酸，简称rRNA，是细胞合成蛋白质的主要场所。 核酸的结构与特征 核酸的结构 一级结构：核苷酸以3’，5’磷酸二酯键构成无分支结构的线性分子 二级结构：双螺旋结构 或局部双链 三级结构：超螺旋结构 四级结构：DNA与蛋白质形成复合物 核算的结构与特征 核酸的特性 核酸的变性作用 爆发式 Tm值 核酸的复性作用 骤然冷却 缓慢冷却 核酸的杂交 在适宜的条件下，将不同来源的DNA放在试管里，经热变形后，慢慢冷却，让其复性。若这些异源DNA之间在某些区域有相同的序列，则可以通过互补碱基多之间非共价键（氢键）的作用，形成稳定的双链区，即复性形成杂交DNA 探针（probe）：利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，通常把标记的分子叫探针 探针技术与核酸分子杂交技术相结合 核算杂交的方法 固相杂交 固相支持物应具备的特征： 1、具有较强的结合核酸分子的能力 2、与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应 3、与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落很少 4、非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉 5、具有良好的机械性能 固相杂交类型： Southern印记、Northern印记、组织原位杂交、菌落原位杂交等 液相杂交 核酸探针的制备 概述 核酸探针 以研究和诊断为目的，用来检测特定序列核算的DNA或RNA片段。 核酸探针的种类 DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 优点 缺点 核酸探针的标记和检测 放射性标记 32P和35S 切口移位法 随机引物延伸标记法 末端标记法 125I标记RNA和DNA 非放射性标记 生物素、洋地黄毒苷配体-dUTP、辣根过氧化物、碱化基团半抗原、荧光素、化学发光剂、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶 间接标记法 直接标记法 DNA探针的吖啶酯标记 Southern印迹杂交 概述 Southern blotting 将待测核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物上，即印迹 固定于膜上的核酸同标记的探针在一定的温度和离子强度下退火（复性），即分子杂交过程 Southern blotting 待测核算样品的制备与限制酶消化 采集样本、提取DNA 基因组DNA很长，通常用限制性酶消化 Southern blotting 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品 目的：按片断长短进行分离，确定杂交靶分子的大小 琼脂糖凝胶浓度的选择 电泳，EB染色，紫外灯观察凝胶 Southern blotting 电泳凝胶的预处理 为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb一下 0.25mol/L HCl短暂脱嘌呤，碱液浸泡，使DNA变性病断裂形成较短的单链DNA片段，用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液，然后在20×SSC中平衡凝胶10min Southern blotting 转膜 常用固相支持物：NC膜和Nylon膜 常用转膜方法：细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法等 Southern blotting 探针标记 预杂交与Southern杂交 将膜上所能与DNA结合的位点全部封闭，即预杂交的目的；预杂交后杂交 2×SSC淋洗膜后置于合适的容器中并加入10ml左右的预杂交溶液，65℃转动或摇动3-4h；煮沸探针5-10min使其变性，立即加入65℃预热的杂交液；倒去预杂交液并加完成的杂交液， 65℃转动或摇动过夜 Southern blotting 洗膜 采用核素标记的探针或发光剂标记的探针进行杂交的关键一步 放射性自显影检测 X线底片曝光与洗片 Southern blotting 注意事项 Northern 杂交技术 实验原理： Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术。其基本