第四章固定化酶.概述.pptVIP

第章四 酶、细胞、原生质体固定化 酶具有专一性强，催化效率高和作用条件温和等显著特点，但是在使用酶的过程中，酶存在不足： 一、概述 Immobilized enzyme 60年代后期，固定化技术迅速发展。 1969年，日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 此后，固定化技术迅速发展，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。 固定化酶的优点以及局限性 优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 　　固定化过程中往往会引起酶的失活 　　固定化酶活力回收率低，且不适合用于高分子质量的底物。 高果糖浆 也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。 固定化酶法生产高果糖浆 高果糖浆的生产流程 玉米淀粉 → 液化、糖化 → 葡萄糖浆 → 膜过滤 → 离交、浓缩 → 异构化 → 部分变成果糖（42%）→混合 →浓缩、精制→ 55%高果糖浆 参与的酶： α—淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶 葡萄糖异构酶 淀粉酶能将淀粉水解为葡萄糖吗? 固定化菌体 固定化酶和固定化菌体都是以酶的应用为目的，它们的制备和应用方法也基本相同 固定化原生质体 二、 酶固定化 载体偶联法（键合法） 第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶 共价键合法 载体的选择  　　　载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是: ①一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。 ②载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。 ③载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。 ④载休没有或很少有非专一性吸附。 ⑤载体来源容易．便宜．并能反复使用。 常用的不溶性载体： 一类是天然大分子，如纤维素、葡萄糖凝胶、琼脂糖、淀粉以及它们的衍生物等； 另一类是人工合成的高聚物，如甲基丙烯酸共聚物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸共聚物及聚苯乙烯等。 偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。 现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中着决定性作用，必须考虑到酶的偶联效率．固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。 要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进某一活泼基团。然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键。 使载体活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。现分述如下： 可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基形成双偶氮化合物。 ②叠氮法 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用肼处理形成酰肼，最后在HNO2作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。 　首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCL气体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80％水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。 　其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2％HCL在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNO2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤． 　 　再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH8．7磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5℃搅拌反应2—3h，用HCL凋PH4，冷0.001mol/L HCL洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。 ③溴化氰法： 此法能在非常温和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应,已成为近年来普遍使用的固定化方法,尤其是溴化氰活化的琼脂糖已广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。 ④烷基化法： 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。