木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达..docxVIP

木聚糖酶的原核表达与鉴定和真核表达摘要：本实验通过克隆木聚糖酶基因到pTE28a表达载体上，转化BL21表达菌株，用IPTG诱导重组菌，跑SDS后，在目的条带处有目的蛋白的表达，用western blot鉴定该蛋白，确信目的条带是目标蛋白。同时，把目的条带克隆到pPIC9K载体上,转化毕赤酵母表达菌株GS115，甲醇诱导重组酵母，测得木聚糖酶的活性可以达到2.375U/mL。关键字：木聚糖酶；原核表达；真核表达材料与方法菌种来源本实验所用菌种来自于华中农业大学农业微生物国家重点实验室。。。培养基LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH7.0YPD培养基：蛋白胨20 g/L，酵母抽提物10 g/L，葡萄糖20 g/LBMMY培养基：蛋白胨20 g，酵母抽提物10g，100ml 13.4%YNB，2ml 0.02%生物素,5g甲醇，100ml 1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0),定容至1L菌种的活化将甘油管保存的含空载和目的基因的重组大肠杆菌表达菌株在含有50ug/mL的卡那霉素的固体LB培养基中划线，过夜培养，挑取单菌落到含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，培养至对数期，这就是活化的菌株。同时，将甘油管保存的含空载和目的基因的重组毕赤酵母GS115菌株在YPD固体平板上划线，培养至长出单菌落，挑取单菌落到YPD液体培养基中培养至对数期，备用。重组菌的诱导表达重组大肠杆菌的诱导表达按1%的接种量把活化好的重组大肠杆菌接到50ml的含有50ug/mL的卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6，添加终浓度为0.1mM的IPTG，25℃培养6-8h，离心收集菌体，加PBS溶液重悬破碎，再高速离心，取上清液过Ni柱，收集适当咪唑浓度洗脱的蛋白质，跑SDS,并做western blot验证目标蛋白。重组酵母细胞的诱导表达按1%的接种量接种于20mlYPD液体培养基中，30℃,250r/min摇瓶16-18h，待OD600=2-6时，5000r/min离心5min收集菌体，将菌体转入50mlBMMY培养基中（用500ml三角瓶，4层纱布封口），250r/min摇瓶培养，每隔12h补充甲醇浓度至0.5-1.0%（w/v）进行蛋白的表达，并每隔12h取样1ml，测OD600，离心保留上清备用。诱导96h后收集菌体，终止诱导，离心取上清备用。测定全部样品中木聚糖酶的活性。大肠杆菌表达的蛋白质的Ni柱纯化(1)固定镍柱，滴完柱中的乙醇，加3-5ml去离子水洗。(2)至少加5ml（一般为10ml）Binding Buffer 平衡。(3)裂解液，即目标蛋白（预先用0.45um膜过滤），加入柱中。(4)用10-15ml Binding Buffer 洗。(5)洗脱，用含20mM、300mM和500mM的咪唑的Elution Buffer 洗脱，收集300mM浓度的洗脱液。(6)用20%乙醇洗，再用其贮存镍柱。1.6 SDS鉴定大肠杆菌表达的蛋白质及western blot鉴定1.6.1 SDS配制分离胶浓度为12%和浓缩胶浓度为5%的SDS，配制方式:12%分离胶配制(5ml):水 1.6ml30%聚丙烯酰胺 2 ml1.5M Tris-HCl (pH8.8) 1.3ml10% SDS 0.05ml10% 过硫酸铵 0.05mlTEMED 0.002 ml按这个顺序加入各种溶液，混匀后注入制胶板，加500ul水饱和的正丁醇封胶，待分离胶凝固后，倒掉正丁醇，配制浓缩胶。5%浓缩胶配制(2ml):水 1.4ml30%聚丙烯酰胺 0.33 ml0.5M Tris-HCl (pH6.8) 0.25ml10% SDS 0.02ml10% 过硫酸铵 0.02mlTEMED 0.002 ml目的蛋白洗脱液用两倍的上样缓冲液等体积混匀，沸水浴5min，上样电泳。80V电泳至分离胶，调节电压为120V，至溴酚蓝指示剂到胶最底部，停止电泳。小心取下分离胶，放入到染色液中染色30-45min，脱色至无背景蛋白条带清晰。1.6.2 western blot用GST蛋白做阴性对照，xynB蛋白为阳性对照。将样品和两个对照点样跑SDS，电泳完成后切除多余的胶，转移到正点尼龙膜上，4℃下5%脱脂牛奶封闭过夜后，用His标签蛋白的抗体杂交，再用二抗与一抗杂交，DAB显色检测。酵母表达上清液木聚糖酶活性的测定木聚糖酶活性标准曲线绘制a、准确称取烘干至恒重的无水木糖150 mg，用容量瓶定容至100 ml，配制成10 μmol/ml的木糖母液。b、用容量瓶将木糖母液稀释成1.0～1