木聚糖酶在大肠杆菌中的表达..docVIP

嗜热内切木聚糖酶基因xyn10B 克隆及其在大肠杆菌中的表达 Horflcoshi 于 1973 年首次报道了来自细菌中的木聚糖酶以来，国外科研Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 分离出木聚糖酶基因 xyn10B，连接于表达载 pET-28a（+）的 NcoⅠ和 XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达质粒pET28a-xyn10B，转化大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codon plus-RIL，构建基因工 1 实验材料 1.1 菌株和质粒 1）Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725； （2）质粒 pET-28a； 3）大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）codonplus-RIL； 1.2 实验材料及主要试剂 抗生素 1.2.2 试剂 ；PCR引物合成；DNA测序；； 1.2.3 工具酶 Nco I、Xho I、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Marker（DL2000 DNA Marker和λ-HindⅢ digest DNA Marker）。 1.2.4 试剂盒 PCR产物回收试剂盒DNA凝胶回收试剂盒Ni-柱纯化柱料。 培养基及主要试剂配制 1）TAE buffer：核酸电泳缓冲液 Tris-乙酸 0.04 mol/L EDTA 0.001 mol/L （2）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris碱 15.1 g 94 g SDS 5 g 去离子水补齐至1000ml。 3）考马斯亮蓝染色液配方 /水（1 :1，v/v） 90 ml 10 ml 考马斯亮蓝R250 0.25 g 应用What man1号滤纸过滤，除去杂质，室温；备用。 4）考马斯亮蓝脱色液 100mL 乙酸 50mL 蒸馏水定容至1L。 5）8×bindingbufferNaCl 4 M Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM 6）8×charge buffer NiSO4800 mM （7）8×washbuffer800 mM NaCl 4 M Tris-HCl（pH 7.9） 160 mM 8）4×strip buffer EDTA 400 mM NaCl 2 M Tris-HCl（pH 7.9） 80 mM 9）蛋白质 SDS凝胶的配制 分离胶 12%（5mL） 浓缩胶 5%（2mL） H2O 1.6 1.4 30%丙烯酰胺溶液 2.0 0.33 1.5mol/L Tris-HCl（pH8.8） 1.3 1.0mol/L Tris-HCl（pH6.8） 0.25 10%SDS 0.05 0.02 10%过硫酸铵 0.05 0.02 TEMED 0.005 0.002 （10）宽范围缓冲液 100mM N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPS） 100mM N-三（羟甲基）甲基-3-氨基丙磺酸（TAPS） 100mM 3-环已胺基丙磺酸（CAPS） 100mM 2-码啉乙磺酸（MES） 100mM 分别在60℃，70℃下精确配制100mM不同pH的缓冲液，使用1M NaOH调节 pH值。 实验仪器 0.22μm无菌滤器、冷冻高速离心机2550 紫外分光光度计Gene pulser Xcell、实验室水纯化系统、超滤管 Ultrafreet-MC 10kDa、AKTA prime plus 蛋白层析仪Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725 的液体培养 DSMZ 的配方，配置厌氧培养基，分装于厌氧 5ml，培养基封闭后用真空泵将试管中的空气抽干，并充入一定量80%N2和 20%CO2）。在厌氧箱中用培养基1m溶解购买于 DSMZ的 Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725，按照 1%的接菌量接5ml 试管中，混匀，75静置培养数天，直至细菌开始生长起来然后转移100ml培养基的锥形瓶中 75培养数天，-80保存菌体备用。基因组 DNA 的提取5ml小试管培养的 Caldicell