实验2分离以尿素为氮源的微生物解析.pptVIP

实验2：分离以尿素为氮源的微生物 1. 使用专一的培养基（含尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。 2.使用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。 脲即尿素，是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的氮源。 (NH2) 2C=O+H2O 2NH3+CO2 脲酶 本实验内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，了解它在生态平衡中的作用，并与LB全营养培养基做对照。 细菌 尿素 NH3 中性 碱性 酚红颜色： 黄色 红色 细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中的尿素分解，产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄变红。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大。 设备及用品： 灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶1个和100 ml的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管（15mm×150mm）3支和试管架 实验材料： (1)25mlLB固体培养基：蛋白胨0.25g、酵母提取物0.12g、NaCl 0.25g、琼脂糖0.5g、加水25ml。 (2) 25ml尿素固体培养基：0.025g葡萄糖、NaCl 0.12g、K2HPO40.12g、酚红0.25mg、琼脂糖0.5g、加水15ml。灭菌冷却到60℃时加入经G6玻璃漏斗过滤（使其无菌）的尿素。 ?滤除1.5~0.6um的病菌 2g 琼脂糖 1.0g 尿素 0.1g 葡萄糖 1g 酚红 0.48g NaCl 0.48g K2HPO4 土壤中分解尿素的细菌的分离所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖 氮源：尿素 选择培养基 (1) 灭菌：将配制好的25mlLB固体培养基装入100ml的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。 (2) 制平板：在60℃左右时,在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在2个培养皿中，在水平的超净工作台上摇匀，平放至凝固。 (3)制备细菌悬液：在无菌条件下,将1g土壤加到有99mL无菌水的三角瓶中,振荡10min,即成为10-2土壤稀释液。依次制备10-3、10-4和10-5土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。 (4) 平板涂布分离：取10-4和10-5土壤稀释液各0.1mL，分别加到LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁边打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。 涂布前后三角刮刀需要灼烧吗？ (5)培养皿倒置培养：在37℃恒温箱中培养24-48h, 观察菌落数。 恒温37℃培养结果 LB培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果 尿素培养基上10-2、10-3、10-4 、10-5稀释度土样涂布结果 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 分析与讨论： 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？ 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物，如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，与其他阴离子形成化合物则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循环 2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用？ 3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？ 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境里变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株可以以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强 4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？ 能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，而且尿素还可以在高温下自然分解，因此，以尿素为氮源的菌群较少