Chapter15分子生物学方法例析.ppt

分子生物学方法 一、RACE技术 是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE，用于扩增3’端的称为3’RACE。 5’ RACE 在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成 RNase混合物降解模板mRNA，纯化cDNA第一条链。 用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP 以连有oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增，以期得到目的片段，并可用nest PCR进行检测。 3’RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。 用RNaseH 降解模板mRNA。 用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段，并可用nest PCR的方法继续进行检测和扩增。 二、cDNA差示分析法 (representational difference analysis, RAD） 充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，仅以线形形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异性扩增目的基因片断。 三、Gateway大规模克隆技术 Gateway技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切出反应。 相对酶切构建载体来说，该技术具有需时短、操作简单、易于各实验室交流的特点，即只需通过简单、高效的BP和LR 反应就可实现把PCR 产物定向转入克隆质粒和表达质粒，实现PCR 产物在各种质粒间的转移。 四、基因的图位克隆法 所有具有某种表现型的基因都可通过该法克隆得到。首先，通过构建遗传连锁图，将目的基因定位到某染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来 染色体步移（genome walking） 是一种克隆方法，可以获得与已知序列相邻的未知基因组区域。 五、原位杂交技术 原位杂交（ISH）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 荧光原位杂交（FISH） 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 六、基因定点突变技术 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 主要采用PCR方法 基因敲除技术 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特点。 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时 间和空间的基因敲除。 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统 应用最为广泛。 2. 高等动物基因敲除技术 真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建 重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法 把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整 合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方 便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 模式动物小鼠中完全基因敲除的主要技术 策略与应用。 3. 植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA