GFP的简介和应用.docxVIP

GFP的简介和应用【摘要】源于多管水母属等海洋无脊椎动物的绿色荧光蛋白（GFP），是一种极具应用潜力的标记物，有着极其广泛的应用前景。本文就GFP的理化性质、荧光特性、改进以及它在科学研究中发挥的作用进行了综述。【关键词】绿色荧光蛋白（GFP）、标记物、荧光特性、进展、改进、应用、干细胞移植【正文】一、GFP的简介1. GFP的理化性质，荧光特性及其改进1.1 GFP的理化性质从水母体内分离到的GFP基因，长达2.6kD，由3个外显子组成，分别编码69、98和71个氨基酸。GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白。AequoriaGFP分子量约27×103，一级结构为一个由238 个氨基酸残基组成的单链多肽；而Renilla GFP是分子量为54kD的同型二聚体。两种GFP有不同的激发光谱，Aequoria GFP在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；Renilla GFP在498 nm具有强烈的光吸收，肩峰为470 nm。两种GFP含有相同的生色团，发射光谱基本相同（λmax= 508~ 509 nm）。GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。其变性需在90℃或pH4.0或pH12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是，它们在很大的pH范围内的吸收、发射光谱也是相同的。RenillaGFP的稳定性就更为显著。它在上述一系列的变性条件下都很稳定，不易变性。根据Sheen等的研究，GFP在受体内表达时，其稳定性并不亚于CAT 蛋白，因而可以得到持续时间较长的荧光。1.2 GFP的荧光原理GFP的性质和发射光谱的稳定性是同其生色团结构的稳定性密不可分的。GFP表达后折叠，在氧存在的条件下，使66位氨基酸残基的α、β键间脱氢。由65~ 67位的氨基酸残基（Ser- Tyr – Gly）环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮（4- p- hydroxybene- 5- imidazolinone），形成生色团（基于组成生色团的元件不同，可将已知的GFP及其变种分为7种，每一种都有一组不同的荧光激发和发射波长)。GFP无需再加任何底物和辅助因子，在紫外或蓝光激发下就能发荧光，在450~ 490nm蓝光激发下，GFP荧光至少能保持10min以上，不像其他荧光素，荧光容易淬灭。其中，GFP的一个引人注目的特点，其生色团的形成没有物种的特异性。可以在翻译后2~ 4h通过自动催化作用来合成。Cubitt等认为生色团自身环化的驱动力来自蛋白质三维结构的形成，由此Kolb等提出一个假说，即环化在新合成的多肽的折叠过程中进行。1.3 GFP的荧光性质及应用优点GFP的荧光性质比较特殊，具有诸多优点而备受关注。（1）易于检测，灵敏度高。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到。其次，即便是未经纯化的GFP发射的绿光也是相当强的，在正常室内光线下仍清晰可辨。对于单细胞水平的表达也可识别。（2）荧光性质稳定。GFP对光漂白（一种荧光衰减现象）有较强的耐受性，能耐受长时间的光照，从而延长了可探测时间； GFP在pH7~ 12范围内也能正常发光，对高温（70 ℃）、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。（3）对细胞无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，与目的基因融合后，对目的基因的结构功能没有影响，转化后细胞仍可连续传代。（4）构建载体方便。由于编码GFP的基因序列很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。（5）可直接用于活细胞测定。GFP 是能在异源细胞内表达后，能自发产生荧光的蛋白，并且GFP的分子量较小，N-端和C-端都能忍受蛋白的融合，是理想的标记物，可进行活细胞实时定位观察，更能接近自然真实的状态。如在活细胞中直接观察蛋白向细胞核、内质网运动的状态，还可实时观察到外界信号刺激下，目的蛋白的变化过程，借助荧光显微镜观察，使研究更为方便。使用激光共聚焦显微镜，其图像效果更佳，结合现代的计算机软件，可进行三维显示。（6）不受假阳性干扰。由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料，避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠。（7）广谱性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达，其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。（8）易于得到突变体。如GFP中氨基酸的替换可产生不同光谱特性的突变体，且增强