GFP及其应用.docxVIP

荧光蛋白：再来一次诺奖？一、绿色荧光蛋白的研究史1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria)中分离出了GFP (Green-Fluorescent Protein) 。水母体内有一种发光蛋白——Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色萤光。这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质，就是GFP 。1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河。1995年，钱永健完成的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。他的主要贡献在于利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应，他是这方面公认的先驱。二、GFP在研究中的应用GFP作为新型报告基因用于转基因研究作为报告基因构建基因工程载体。以GFPS65T基因作为筛选标记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代Lacz蓝白斑筛选，不需X一gal。2.GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用 Hale C.A.等利用 GFP标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA间的相互作用，发现，ZipA-GFP融合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于FtsZ与膜相关的特殊环中。3.GFP作为一种新型免疫标记物利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。4.用于植物信号转导研究 GFP结合荧光共振能量转移(FREP)为研究植物信号转导也提供了新方法。例如： Allen等用 YEP-GFP-Ca2+传感器检测拟南芥保卫细胞内Ca2+浓度的变化，结果表明，外源的Ca2+和 ABA都能引起保卫细胞内Ca2+浓度的变化。这和过去用荧光染色法观察到的结果一致。5.GFP用于微生物与宿主相互作用研究 利用GFP 标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等侵染植物的过程和机制。Bowyer 等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸酶启动子的GFP 基因，监测到T. yallundae侵染小麦时的碳代谢过程。三、荧光蛋白在脑研究中的应用——光遗传学2002年，杰罗·麦森伯克（GeroMiesenb?ck）实验室首先尝试了这个大胆的设计，他把来自于非脊椎动物的感光蛋白（metarhodopsin）表达在体外培养大鼠皮层神经元上，观察到了变视紫质（metarhodopsin）可使神经元兴奋。这是实现光控细胞活动最早的一个成功的实验。2005年，杰罗·麦森伯克进一步把变视紫质表达在果蝇肌肉细胞上。再把果蝇砍去头，这样果蝇扇翅膀的运动就不能被自身的运动神经所控制。然后，再把光打在果蝇身体上，没头的果蝇竟然拍翅膀了。因此，2003年，当皮特·黑格曼（Peter Hegemann）实验室连续发表了两篇微生物中的单个光敏离子通道（channelrhodopsin）ChR1和ChR2时，许多神经生物学家精神为之一振，世界各地同时有四个实验室尝试表达于哺乳动物细胞，可谓英雄所见略同。他们分别为美国斯坦福大学的卡尔·德塞罗斯（Karl Deisseroth）实验室，美国凯斯西储大学（Case Western Reserve University）的林恩·兰德梅塞（Lynn T. Landmesser）和斯蒂芬·赫利茨（Stefan Herlitze）实验室，日本的HiromuYawo实验室以及美国韦恩州立大学（Wayne state University）的潘卓华实验室。德塞罗斯实验室的文章是最先发表于2005年8月Nature Neuroscience，但只做了体外培养的细胞表达，值得一提的是发展了CRSIPR/cas9工具的张锋也参与了这项工作，他是第二作者。仅仅迟了两个月的兰德梅塞和赫利茨实验室就做得全面很多，有体外培养海马皮层神经元表达，以及在体脊髓神经元表达。日本的HiromuYawo实验室比德塞罗斯迟了3个月，但是也做了体外培养细胞系PC12的表达和改变细胞兴奋性的实验。但是最晚于2006年4月发表的潘卓华老师实验室的工作做得最全面，从体外细胞表达到小鼠在体神经细胞表达和电生理记录一应俱全。实际上据潘卓华老师介绍，2004年底，他的在小鼠视网膜体内表达的实验就已经完成，而且依次投递了Nature和Science，但是都未被接受，甚为遗憾，这部分历史在黑格曼的综述中有客观叙述。2006年后，光遗传学的时代来临了，光遗传学给物理