第03章 抗体制备.pptx

临床免疫学检验技术第三章 抗体制备王 辉目 录第一节 免疫原的制备第二节 免疫佐剂第三节 多克隆抗体的制备及应用第四节 单克隆抗体的制备及应用第五节 基因工程抗体及应用?抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性免疫应答的重要产物，也是免疫学实验中的常用试剂，对于抗原的分析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学实验室诊断中广泛应用。第一节 免疫原的制备免疫原（immunogen）是能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。在抗体制备过程中，多种因素能够影响所制备抗体的质量，但高质量的免疫原是制备合格抗体的前提条件。一、颗粒性抗原颗粒性抗原主要包括人和各种动物细胞抗原、细菌抗原和寄生虫抗原等。常用的抗原为: 绵羊红细胞、细菌抗原和细胞膜抗原。二、可溶性抗原蛋白质（糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体和细菌外毒素）、多糖和核酸等都是可溶性抗原。（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提组织细胞抗原的制备：粉碎的方法有两种：高速组织捣碎机法和研磨法。细胞可溶性抗原的制备：常用的细胞破碎方法有超声破碎法、酶处理法、冻融法和表面活性剂处理法。（二）可溶性抗原的纯化一般采用的纯化方法有超速离心法、选择性沉淀法、凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。（三）免疫球蛋白片段的制备免疫球蛋白片段的制备方法有解离二硫键、溴化氰裂解法和酶裂解法。三、半抗原半抗原（hapten）是指只有抗原性而无免疫原性的物质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他化学物质等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把半抗原与蛋白质等大分子物质结合后，才能剌激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。半抗原-载体的连接方法：带有游离羧基或游离氨基以及两种基团均有的半抗原带有羟基、醛基和酮基的半抗原芳香族半抗原第二节 免疫佐剂免疫佐剂( immunoadjuvant)是指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。一、佐剂的种类主要包括：生物性佐剂、无机化合物佐剂、人工合成佐剂。弗氏佐剂（Freund adjuvant,FA）可分为:弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂。佐剂与抗原混合乳化的方法有两种：研磨法、搅拌混合法。二、佐剂的生物学作用1.增强抗原免疫原性，使无或弱免疫原性的物质成为持久或强免疫原。2.增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次免疫应答产生抗体的效价。3.促进抗体类型转换，使产生的抗体由IgM转变为IgG。4.引起或增强迟发型超敏反应。三、佐剂的作用机制1.改变抗原物理性状，延缓抗原降解，延长抗原在体内的停留时间，从而有助于抗原提呈细胞(APC)对抗原的摄取。2.诱导产生炎症反应，吸引APC到达炎症感染部位并使之活化,增强APC对抗原的加工和提呈。3.刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。第三节 多克隆抗体的制备及应用一、免疫动物的选择抗原与动物种属之间的关系动物的个体因素抗原的性质与动物种类抗体的用量和要求IgY有如下几方面的优点 无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取抗体； 使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY； IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在，因此容易保存和运输； 由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉反应； IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果； IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。二、抗原剂量的选择抗原的注射剂量应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。三、免疫程序动物产生抗体的过程符合抗体产生的一般规律—即初次免疫应答和再次免疫应答的规律。一般在首次接触抗原7天～10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14天～21天内达到高峰，随后开始下降。通常首次免疫后3周左右进行加强免疫，加强免疫至少2次，必要时需3次～5次。四、采血方法颈动脉放血法静脉采血法心脏采血法五、抗血清鉴定及保存抗体效价和纯度的测定抗体特异性的鉴定抗体亲和力的鉴定抗血清的保存六、抗体的纯化IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换层析提取IgG、亲和层析法。特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法七、多克隆抗体的特性和应用 用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的新生儿溶血症等。 用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。第四节 单克隆抗体的制备及应用单克隆抗体（McAb）的特点是理化性状高度均一、纯度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验标准化和大量制备。一、杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂