红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯.doc

毕业设计/论文 开 题 报 告 课 题 名 称 红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 类 别 毕 业 论 文 系　 别 城 市 建 设 学 院 专 业 班 生物工程0701班　 姓　 名　 于 凯 评 分 指 导 教 师 华中科技大学武昌分校 华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告 学 生 姓 名 于 凯 学 号 20071171005 专业班级 生物工程0701班 系 别 城市建设学院 指导教师 余龙江 职 称 教授 课 题 名 称 红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 1 课题研究的目的和意义 1.1 课题研究背景 1.1.1 有关红豆杉 红豆杉濒临灭绝的天然抗癌植物由于在自然条件下生长缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。中国已将其列为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。 在全共有十一种，目前我国共有四种和一个变种，即云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种东北红豆杉主要分布在中国境内的红豆杉东北红豆杉含量最高，可达万分之三云南红豆杉主要分布在滇西与地洲西藏红豆杉主要分布在云南西北部、西藏南部和西南部南方红豆杉主要分布在滇东、滇西南、滇东。曼地亚红豆杉是我国20世纪90年代中期从加拿大引种而来原产于美国、加拿大，是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉。引种的曼地亚红豆杉生物特性稳定，没有发生变异，紫杉醇含量接近原产地。分子式为：C47H51NO14是红豆杉属植物中的一种复杂的天然次生代谢物主要由紫杉烷环和侧链组成是高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。研究生物合成对于人为定向的提高合成效率克隆形成关键酶基因提高紫杉醇的产量意义重大。红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ过四步化学过程可合成紫杉醇。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 ③ MYB基因的功能 通过转录因子在转录水平上调控目的基因表达是植物对其生长发育及生理代谢调控的一种重要方式。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之 1.2 研究的目的和意义 先从红豆杉细胞中克隆MYB基因，探索这种基因表达的转录因子与红豆杉细胞中次级代谢产物紫杉醇的表达量的关系。从而为构建基因工程植株，工业化生产紫杉醇提供依据。 探索红豆杉细胞中转录因子对其次级代谢产物紫杉醇的调控作用，有利于了解紫杉醇的生物合成途径，能够给构建高产紫杉醇的转基因工业化菌种或植物提供方向。如果MYB基因的表达确实在调控紫杉醇的合成过程中起到促进作用，接下来就可以建立转基因植株，以及建立更为期待的转基因工程菌种，为紫杉醇的工业化生产提供思路。这一方面有利于满足当今社会人们对这种抗癌特效药的需求，也在另一方面保护了红豆杉物种，维持了生态平衡，实现了生态的可持续发展。 2课题研究的主要内容 2.1 本课题研究的切入点 MYB转录因子在多种植物中参与了次生代谢产物的调控，如在苯丙素代谢途径中的关键调控作用[15]，以及对于花色素苷的产生起着关键作用[16]，而且能够有效增强类黄酮生物合成基因的表达[17]，等等。目前，许多研究表明，作为代谢途径的关键基因的转录因子，MYB基因的表达产物对于萜类次级代谢产物的合成至关重要[18]。紫杉醇就是一种四环二萜类化合物[19]，它在红豆杉中的生物合成是否也受到MYB转录因子的调节，参与紫杉醇生物合成途径的关键酶基因的启动子是否能够被MYB转录因子所识别，从而调控这些基因的表达。因此，本课题从转录调控的角度，探索红豆杉MYB转录因子在其次级代谢产物合成过程中的作用，尤其是对于代谢产物紫杉醇的调节作用。 2.2技术路线 3. 研究方法 3.1 研究方案 （1）提取红豆杉总RNA ①Trizol法提取总RNA ②浓度和纯度检测：用紫外分光光度计测定样品OD260、OD280和OD230的值以及 OD260/OD280和OD260/OD230的比值。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、完整性。 （2）逆转录合成第一链 按照反转录试剂盒说明书的方法合成cDNA第一链。 （3）利用特异引物扩增cDNA PCR扩增程序：95℃预变性6min，94℃变性40s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环后降温