BCA蛋白浓度测定.docVIP

化学名称：2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠 CAS号：979-88-4 分子式：C20H10N2Na2O4 · xH2O 分子量：388.28 化学性质：淡黄色粉末、有吸湿性，溶解于水或者乙醇。 质量标准 外观Appearance 淡黄色粉末 红外光谱鉴别Infrared spectrometry 符合 纯度Purity ≥98.0% (HPLC) 水分Moistrue ≤4% 铁Iron(Fe) 5PPM 重金属Heavy Metals 5PPM 灼烧残渣Residue On Ignition ≤0.1% 水溶性试验Solubility 500mg/ml水 摩尔吸收系数Molar Absorptivity 3.74*104（氧化产物） 应用范围 该复合物在562 nm处有最大吸光值，并与蛋白浓度成正比。以BSA为标准品求得标准曲线，进而计算未知蛋白样品的浓度，故BCA常用于蛋白定量检测，是蛋白定量试剂的重要原料。应用 BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。 器材 1. 7220型分光光度计 2. 比色杯 3. 恒温水浴箱 4. 中试管7支 5. 枪式移液管 试剂 1. 试剂A： 1%BCA二钠盐 2%无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4%氢氧化钠 0.95%碳酸氢钠混合调PH值至11.25。 2. 试剂B：4%硫酸铜。 3. CA工作液：试剂A100ml+试剂B2ml混合。 4. 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1~5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 5. 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。 注意事项 1)???????? 使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量。 2)???????? 低温或长期保存，若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生。请37oC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应丢弃，避免对实验结果造成影响。 3)???????? 实验操作规范，提高上样量的精确度。 4)???????? 每次测定都需做相应的标准曲线，因为显色反应与温度和时间的变化有关，精准的蛋白定量宜每次都做标准曲线。 操作方法 一、配制标准品和工作液 1. 配制BSA标准品体系 注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。 BSA标准品体系配制可参考表一。 表一BSA标准品体系配制（微孔板检测，线性范围20-2000μg/ml）* 管号 稀释液体积（μL） BSA来源及体积（μL） BSA终浓度（μL/mL） A 0 300的原液 2000 B 125 375的原液 1500 C 325 325的原液 1000 D 175 175的B管稀释液 750 E 325 325的C管稀释液 500 F 325 325的E管稀释液 250 G 325 325的F管稀释液 125 H 400 100的G管稀释液 25 I 400 0 0=空白 *如用比色皿检测，每管需加100μl标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μl。 加强试管协议的稀释方案（活性范围=5-250μg/mL）可参考表二 表二 管号 稀释液体积（μL） BSA来源及体积（μL） BSA终浓度（μL/mL） A 700 100的原液 250 B 400 400的A管稀释液 125 C 450 300的B管稀释液 50 D 400 400的C管稀释液 25 E 400 100的D管稀释液 5 F 400 0 0=空白 2. 配制BCA工作液 1)???????? 计算所需要的总BCA工作液体积。 总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液 注：比色皿检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。 2)???????? 配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1） ，充分混匀。 注：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温