PCR技术及其在动物科学领域的运用.docVIP

PCR技术及其在动物科学领域中的运用 摘要：聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增　　聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction）， 简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何DNARNA的地方聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。技术原理 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 2、PCR工作原理 　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性模板DNA经加热至90~95一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 RT-PCR 原理：首先提起RNA，然后用逆转录酶与MRNA为模板进行CDNA第一链的合成，RT-PCR是个半定量的试验，可以确定在MRNA水平的表达差异，即在转录水平 免疫PCR(immuno polymerase chain reaction , IPCR 原理：是用一段已知DNA 分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR 扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA 分子,电泳定性,根据特异性PCR 产物的有无来判断待测抗原是否存在免疫PCR是迄今最敏感的一种抗原检测方法,理论上可以检测单个抗原分子,但实践中它的敏感性受许多因素的影响,如连接分子、显示系统的选择、DNA 报告分子的浓度、PCR 循环次数等由于PCR 产物在抗原量未达到饱和前与抗原抗体复合物的量成正比,因此免疫PCR 还可用于抗原的半定量试验。 巢式PCR 原理：是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片段先用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增. 巢式PCR比较适合微量DNA或者石蜡组织抽提的DNA （4）、实时荧光PCR利用荧光来检测PCR产物，PCR每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定CT值，从而确定其实DNA拷贝数 实时PCR，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析的定量使用荧光色素，目前有二种方法一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman探针。两种方法原理不同。SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）” （5）、原位PCR技术：原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PC