SSR实验操作流程..doc

SSR实验操作流程 比较功能基因组学实验室 一、试剂配制 0.2%亲水binding silence（现配现用） 1500μL95%乙醇，7μL冰醋酸，再加入3μL binding silence，混匀后使用。 注：硅烷可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。特别易燃，要远离热、火花和明火。其挥发的气雾对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有刺激作用。戴合适的手套和安全眼镜、始终在化学通风橱里使用。 0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用） TBE母液（5×TBE） Tris Base 54g 硼酸 27.5g EDTA(0.5M pH8.0) 20ml 搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。 注：如果用得比较多，可以配成10倍或者20倍的备用。 Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE 12ml 尿素 27g 加双蒸水溶解后定容至51ml，使用滤纸过滤。 注：冬天配制时可以用微波炉加热使之迅速溶解，最好立即趁热过滤，使用时间不宜过长，尽量在3周内用完。 尿素可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康，戴合适的手套和安全眼镜。 40％丙稀酰胺 丙稀酰胺 380g 甲叉双丙稀酰胺 20g 加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用滤纸过滤，棕色瓶避光保存于室温。 注：丙烯酰胺（未聚合的）是一种强的神经毒素并可通过皮肤吸收（其效应是累加的）。当称量粉末状丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺时，要佩戴合适的手套和防护面具，在通风橱内操作。人们多数认为多聚丙烯酰胺是无毒的，但亦应小心操作，因为可能含有少量未聚合的丙烯酰胺。 10％APS（过硫酸铵） 超纯过硫酸铵 2g 超纯水 18ml 溶解后，4℃保存，一个月之内用可以不放4℃保存。 注：过硫酸铵对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大的危害性。操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱内操作，操作完后彻底洗手。 TEMED（购买后可直接使用） 电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。 注：TEMED对粘膜和上呼吸道组织、眼睛和皮肤有极大的危害性，吸入和致命。长时间接触可引起严重的刺激或灼伤，操作时戴合适的手套、安全眼镜和防护服。始终在通风橱内操作，操作完成后彻底洗手。TEMED挥发的气体能传到相当远的火源并引起花光四闪。切勿靠近热、火花和明火。 Loading buffer： 去离子甲酰胺 100ml 0.5M EDTA(pH8.0) 2ml 二甲苯腈蓝cyanol 0.05g 溴酚蓝 0.05g 混匀后置于4℃保存。 注：购买蒸馏的去离子化甲酰胺，分装成小份充氮贮存于-20℃，或购买去离子化试剂级的甲酰胺。许多批号的试剂级甲酰胺已足够的纯，无须进一步处理即可使用。但是，如果呈现黄色，则必须进行去离子化处理。处理方法见《分子克隆实验指南》。甲酰胺是一种致畸剂，其挥发的气雾对粘膜、上呼吸道组织、眼睛和皮肤有刺激作用。可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康。戴合适的手套和安全眼镜。当用浓的甲酰胺工作时，要始终在化学通风橱内进行，工作液尽可能的遮盖。 固定液： 无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。 染色溶液(ACS 试剂)： 无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。 注：染色液配置用双蒸水。AgNO3是一种很强的氧化剂，要谨慎操作。它可因吸入、咽下或皮肤吸收而损害健康，避免接触皮肤、戴合适的手套和安全眼镜。与其他物质接触可引起爆炸。 显影溶液： 15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。 注：显影液可以用自来水配置，每次用时重新加甲醛，甲醛有很大的毒性并挥发，也是一种致癌剂。很容易通过皮肤吸收，对粘膜和上呼吸道组织、眼镜和皮肤有刺激损伤作用。避免吸入其挥发的气雾。戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱内使用，远离热、火花和明火。二：实验步骤 1、玻璃板清洗准备： 1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，沥干备用。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放过夜。 2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，可以用酒精轻轻擦拭