基因工程介绍一种新技术.docVIP

环介导等温扩增技术的研究 随着分子生物学技术的发展，以检测核酸为基础的分子生学技术如PCR[1]、再生式序列复制[2]以及链置换扩增技术[3，4]等广泛应用于医学和生物学等领域，在医学诊断和传染病病原体的检测方面发挥了重要的作用。由于核酸的分子生物学技术需要昂贵的仪器设备、操作程序复杂等缺点，大大限制了其作为快速诊断方法的使用。环介导等温扩增技术(LAMP)的问世[5]，解决了核酸诊断上出现的诸多难题，使其作为快速诊断成为可能。自LAMP技术建立多年以来，该技术已经广泛应用于对病毒，细菌，寄生虫以及环境中细菌等病原体的检测研究，取得了可喜的成就。本文就该技术的方法及研究进展综述如下。 1　环介导等温扩增技术的原理 环介导等温扩增技术是用一套四条特异性引物与靶基因的六个不同区域退火杂交，在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下扩增DNA分子的核酸扩增新技术，具有高特异性、高效率、便捷等特点[5]。 2　引物设计 环介导等温扩增对引物特异性的要求更高，设计也更为复杂，环介导等温扩增需要两对引物即两条外部引物和两条内部引物，外部引物限定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供了模板。每条内部引物的两段DNA短片段通过TTTT序列连接[5]，也有研究结果认为在内部引物之间不加TTTT序列并不影响等温扩增，说明TTTT序列在串联内部引物上并不是必需的[6]。最近NagamineK等的研究提示在LAMP反应中加入环引物能够明显加快等温扩增的速度，大大提高了检测效率，检测率比没有加环引物的高7个数量级[7，8]。 3　扩增反应 与传统PCR技术相比，LAMP技术简化了94℃变性步骤，同时退火和延伸在同一温度(等温)条件下进行;反应体系的组成也较传统PCR复杂，除了反应体系中必须的缓冲液、dNTP、引物、酶和MgCl2等成分外，还须加入甜菜碱、硫酸铵等必需成分;整个扩增反应历时短，一般为30～60min即可判定结果。由 于LAMP扩增的反应体系较为复杂，因而对影响整个反应的主要成分如MgCl2和甜菜碱的浓度，内、外部引物及环引物的浓度比例要进行优化，各成分的最佳浓度是试验中确定的。一般来说，内部引物和外部引物的浓度比为1∶4～1∶10[9]。在进行环介导等温扩增之前一般要求对模板DNA进行变性，即95℃变性5min，60～65℃等温扩增1h左右，80℃2min终止反应整个反应的总体积通常为25LL[7]。有研究认为在LAMP扩增反应中加入未变性的模板并不影响扩增结果，说明对模板DNA的变性在等温扩增中并不是必须步骤[10]。 LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因DNA片段，由于内部引物扩增的DNA片段含有与该引物5′端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构，另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，如此往复循环最后形成菜花样结构，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成;循环扩增阶段;延伸和再循环[5] 4　结果判定 环介导等温扩增结果判定主要方法有:(1)电泳，将扩增产物电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带;(2)直接观察扩增管的浊度。研究发现LAMP阳性扩增管反应后形成副产品焦磷酸镁，而没有发生扩增反应的阴性管中没有副产品焦磷酸镁产生，因此阳性管的浊度比阴性管高，经高速离心后出现更为明显的白色沉淀，阴性对照管则没有白色沉淀[11];(3)加入染料直接用肉眼判定结果。有研究者向其扩增产物中加入能掺入到双链DNA中的荧光染料SYBYGreené，发现电泳结果阳性管加入染料后颜色变为绿色，而没有目的DNA片段扩增的阴性对照管颜色没有发生变化，这一发现使得LAMP结果的判定更为简捷[12，13] 5　环介导等温扩增在病原微生物检测中的应用 5.1　细菌核酸的检测　 首先将LAMP用于细菌检测的是Maruyama，他们用该技术成功检测了水生环境中大肠杆菌的六个基因[14]。之后有许多关于用LAMP对感染人[9]、鱼类[15]以及水生环境中的细菌进行检测的报道，甚至用该方法对病原体进行鉴定和分型[7]。Iwamoto等用LAMP检测了患者痰液样品中的结核分歧杆菌，仅用35min就能检测出固体培养基中的细菌，60min内检测出液体培养基或痰液中的细菌[12]。Song等用改进的LAMP检测了志贺氏属、侵入性大肠杆菌和引起反刍动物慢性进行性肠炎的分歧杆菌的副结核，结果提示LAMP的敏感性高于传统PCR，扩增时间比PCR缩短一半，对副结核杆菌的检出最小范围为0.01pg?L