生物工程大实验基因工程实验内容.docVIP

《生物工程大实验》基因工程 生物工程大实验项目一览表 序号 实验名称 实验项目名称 实验类型 实验要求 学时 每组人数 1 酶工程实验 淀粉酶产生菌的筛选及菌株鉴定 综合性 必做 8 3 淀粉酶的提取 设计性 必做 4 3 淀粉酶固定化及其性质测定 综合性 必做 6 3 2 基因工程 实验 PCR技术扩增产淀粉酶的细菌16SrDNA 设计性 必做 6 3 DNA重组与转化 综合性 必做 6 3 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 综合性 必做 6 3 3 发酵工程实验 微生物生长曲线的测定 设计性 必做 3 3 淀粉酶产生菌发酵条件的优化 设计性 选做 8 3 果酒酵母的流加培养与分批培养 综合性 选做 8 3 果酒的酿造 综合性 必做 7 3 《生物工程大实验》基因工程教案 实验一 PCR技术扩增产淀粉酶的细菌16SrDNA序列 实验目的和内容 目的.学习PCR 扩增细菌16SrDNA序列方法 掌握PCR基本操作技术，以及琼脂糖凝胶电泳技术 内容：1）细菌基因组DNA的提取 2）16S rDNA 序列pcr扩增 3）琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理 1985年美国Cetus公司的Kary Mullis等人设计并研究成功的一种体外核酸扩增技术(polymerase chain reaction PCR),这是一种类似于DNA的天然复制过程，以待增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段的方法。将目的基因DNA在高温（94℃）下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡聚核苷酸引物在低温（30-60℃）下分别与变性的目的的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合；在中等温度（65-75℃）下由耐热DNA聚合酶（Taq酶）将dNTP中的脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起点，沿着模板以5’→ 3’方向延伸，合成一条新的互补链。新合成的DNA链的起点是加入的引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。 图2-1-1PCR的原理 由于PCR反应中，双链DNA高温变性成单链，引物与模板单链DNA低温退火（配对）适温下引物延伸三个步骤反复循环，每一循环所形成的DNA分子均能成为下一循环的模板，所以PCR的特定靶DNA产物以指数方式递增，在数小时内，经过30个循环后，理论上可使DNA扩增至109倍。原来对单拷贝基因进行探测 和分析时需用10ul基因组DNA，现在可以减少到ng水平。 1、设汁和选择高效而特异性强的引物是PCR成败关键。 引物（primer)是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的的寡核苷酸(单链DNA片段)。引物包括引物1和引物2两种。引物1是5’端与正义链互补的寡核菅酸，用于扩增编码链或mRNA链；引物2是3’端与反义链互补的寡核苷酸，用于扩增DNA模板涟或反密码链。当两段引物与变性双链DNA的两条单链DNA模板退火后，两引物的5’端}iJ]决定了扩增产物的两个末端位置，而扩增的片段长度等于两个引物间的序列片 段长度。引物的长度大约为20-30个寡核苷酸，一般可以用DNA合成仪合成。根据统计学计算，长约17个碱基的寡核营酸序列在人的基因组DNA(3×109bp)中可能出现的概率为1次，因此只要引物不少于16个孩苷酸，即能保证PCR扩增的序列特异性。如果引物过短，会产生非特异性结合，而过长会造成浪费。 计引物的原则： ①引物应是DNA序列的一段高度保守区，即与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的，与两个引物结合的两个片段之问的靶DNA序列则未必清楚。 ②引物3’端的保守性很重要，尽量要求使用非简并性密码或简并性较低的密码，如尽量不要选择具有六个密码子的氨基酸。每条引物内部应避免具有明显的二级结构(发夹结构)。所谓发夹结构是指发夹柄至少含有4个碱基配对，而发夹环至少有3个碱基，这种结构尤其避免在引物的3’端出现。如 3’—GATCTGATGC A T G G 5’—CTAGACTACG C C A ③尽可能选择碱基随机分布的序列，即避免具有多聚嘌呤、多聚嘧碇或其他异常序列。引物中G+C碱基含量以40一60％为佳。 ④两个引物之间不应有互补序列，尤其是在引物的3’末端的互补碱基。．不能多于5个，否则会引起“引物间二聚体，一旦形成二聚体，则引物序列就不能很好地与模板结合，从而妨碍PCR扩增。 ⑤根据实验需要可以在引物的5’端引入适当限制酶切位点，以便PCR产物的亚克隆即进入载体分子中。此外在限制酶切位点的5’前面还要添加限制酶的保护碱基2—4个。 如一16SRDNA基因的两端序列为：5’