第二章菌种的选育课件.ppt

分析步骤(BIA) 基因重组过程中的四种遗传体系: 1.异核体:在同一菌丝或菌体中存在不同基因型的细胞核. 2.固体培养基的使用 主要适用于初级代谢产物菌株的筛选 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目） 文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂） →80度30分钟处理 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 从285个土样中获得62株 26株为组成型 36株为诱导型 ↓ 2.4 随机分离方法 1.抗生素产生菌筛选 2.药理活性化合物的筛选 3.生长因子产生菌的筛选 4.多糖生产菌的筛选 2.4 菌种选育 目的: 防止菌种退化 解决生产实际问题 提高生产能力 提高产品质量 开发新产品 2.4.1自然选育 自然选育:在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选的过程. 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。 自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。 自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验 2.4.2 诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 诱变剂 { 物理：紫外，快中子 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍 生物诱变剂 噬菌体 2.4.2.1 诱变育种的一般步骤见 (p38) 整个流程主要包括:诱变和筛选. 诱变育种中的几个注意问题 1.出发菌株的选择 出发菌株标准:产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度大。 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长,这样有利于变异率提高得到很好的重现性。 2.复合诱变因素的使用 出发菌株通常有三种: 从自然界分离得到的野生型; 通过生产选育的菌株即自发突变选育 已经通过诱变选育的菌株. 对于不同出发菌株考虑采用不同的诱变剂进行处理 3.剂量的选择 变异率与致死率有一定的关系,利用致死率作为剂量选择的依据. 4. 变异菌株的筛选 初筛: 总结变异的菌落“形态”特性和产量之间的关系. 根据平皿反应直接挑取高产菌株: 平皿反应:每个菌落产生的代谢产物与培养基的指示物作用后的变色圈和抑制圈等等. 常用方法:纸片培养显色法、透明圈法、琼脂片法、浓度梯度法等等。 以上为产量型的筛选 营养缺陷型的筛选： 经过诱变后，经过中间培养，淘汰野生型、检出营养缺陷型确定生长谱。 淘汰野生型的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等，其目的是浓缩营养缺陷型。 营养缺陷型检查方法：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法等等。 5.高产菌株的获得与筛选条件的配合 出发菌株、诱变因素、筛选条件 2.4.3 物理、化学诱变剂的使用原理方法 1.紫外线：有效波长260nm左右；诱变条件，一般选择15W紫外灯，距菌（孢子）悬液30cm左右，在黑暗或红灯照射环境下进行。 作用机制：形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。 2. 快中子 快中子的生物学效应是由其撞击原子核后产生的质子产生的。 能够引起较多的点突变和染色体变，而产生诱变育种的效应。 3.氮芥(p40) 机理：氮芥的盐酸盐和碳酸氢钠反应释放出氮芥子气，再与细胞作用引起染色体发生畸变。 使用方法： 活化剂和解毒剂的配置 氮芥的盐酸盐配置 诱变作用 诱变终止 4.亚硝酸 作用机制：脱去碱基中的氨基，引起碱基对的转换作用从而造成突变。 5.N-甲基-N/-亚基胍（NTG) 对DNA起到烷化剂和亚硝酸的作用。 6.航天育种 利用空间高真空、微重力和强辐射的特点 2.5 抗噬菌体菌株的筛选 证明抗噬菌体突变在发生与噬菌体接触之前的经典实验： 波动实验、涂布实验、影印实验。 2.5.1 抗噬菌体菌株选育方法： 自然突变； 2. 诱发突变。 2.5.2 抗噬菌体的特性实验 1.抗噬菌体性状的稳定性实验 点滴法、双层琼脂法。 2.抗性菌株的产量实验 3.真正抗性和溶原性的区别