RNAi技术及其应用课件.ppt

现在几乎每天都会有文章对各种小RNA与机体发育之间关系的进展进行报道。而精明的生物技术公司也正在以惊人的速度积极地将RNAi的相关知识运用于药物筛选研究。借助现 今先进的测序技术，人们鉴定出了多种新型小RNA，而随后，它们的强大功能将会继续吸引我们研究下去，相信研究结果一定会让我们感到惊喜。双链RNA能够以序列特异性 的方式导致基因沉默的机制自发现起就对生物学的发展产生了巨大影响，它揭示了人们以前未曾注意到的基因表达调控机制。这种机制被称为RNA干扰（RNAi）或者RNA沉默 （RNAsilencing）。其核心内容是：一些非编码小RNA分子（smallnon-codingRNA，20~30nt）进入细胞后与序列互补的信使RNA靶标配 对，阻止其表达。2004年9月，《自然》首次刊登了美国科学家AndrewZ.Fire与llo等人撰写的关于RNA干扰的成果文章。时隔不久，RNAi技术取得了非凡 的成就。人们逐渐意识到，RNAi将会对生物学的发展带来深远的影响。毫无疑问，打开了RNAi这一潘多拉盒子的AndrewFire与CraigMello获得了200 6年的生理学或医学诺贝尔奖。诺贝尔委员会成员GoranHansson在该年的颁奖词中说道：“RNAi为我们了解生命提供了新视角，并为医学发展提供了新工具。”不过 ，RNAi的故事才刚刚开始，许多悬念有待人们逐个解开。细胞内表达的长dsRNA或外源性长dsRNA（可以是由正链转录产物和负链转录产物配对而成的结构，也可以 是ssRNA内形成的茎环结构）在Dicer酶的作用下降解成小RNA；小RNA的双链解开，其中一条链被优先装载入RNA诱导沉默复合物（RISC）中；装载了小RNA 的RISC复合物就会在细胞内积极地“有哪些信誉好的足球投注网站”转录组，探寻潜在的RNA靶分子。被装载入RISC复合物当中的向导链（guidestrand）--ssRNA随后引导RI SC复合物当中的核酸内切酶（有时被称作“切割机”，现在人们知道它是Argonaute蛋白）反复剪切拥有向导链同源序列的mRNA靶分子。向导链就是通过这种方式来发 挥特异性的RNAi作用的；尽管不同生物体内，参与RNAi途径的蛋白和相关机制各有不同，但是它们的干扰策略却惊人地一致。在所有被研究过的物种中，RNAi都 包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及小RNA与 其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基因组完整性，或产生一系列 特异性的小RNA。随着高通量测序技术的出现以及生物信息学的不断进步，科研人员得以对小RNA的起源及其靶向机制开展更深入的研究。他们发现，在各个不同的物种当中，R NAi系统获得了不同程度的改进，包括进化出“内置式的”分子“刻度尺”，用来控制小RNA的大小和结构，从而挑选出小dsRNA中最合适的那条单链分子进入下一步骤；或 进化出防止“脱靶”现象出现的机制等等。科研人员还发现RNAi通路的活性会在各个水平（从小RNA的生成到RISC复合物的沉默模式）受到严密调控。各种不同的 RNA沉默途径之间存在竞争关系，比如黑腹果蝇中的endo-siRNA和miRNA之间就相互竞争LOQS。这种竞争机制就是RNAi途径中决定每一个阶段里如何发生调 控的关键步骤。很多植物和动物病毒都会编码抑制蛋白来抑制宿主细胞的RNAi途径，使得这些调控机制无法在各个不同阶段发挥正常作用。细胞的蛋白质同样也能够调控RNAi 。比如，在人体胚胎细胞中，miRNAlet-7分子（一种抑癌分子，同时也是一种细胞周期调控分子）的生成过程就是一条转录后被抑制的过程，该途径被多潜能因子LIN2 8所抑制。LIN28蛋白可以阻止pri-let-7分子在微处理器复合物中的剪切过程及后续由Dicer蛋白负责的pre-let-7前体分子的处理过程。不过，人体同 时存在另一条路径。转化生长因子β（TGF-β）和生长因子家族中的骨形成蛋白（BMP）都能促进miR-21这种促癌分子的生成。这是因为这些蛋白能够促进DROSHA 将pri-miR-21转化成pre-miR-21。更确切地说，SMAD蛋白家族成员TGF-β和BMP信号转换因子与RNA解旋酶p68组成的复合物一起被招募至pr i-miR-21，促进pre-miRNA形成。另外，不均一核糖核酸RNPA1蛋白（heterogeneousnuclearRNPA1，hnRNPA1）这种著名的 前体mRNA分子剪切调控因子也会帮助DROSHA发挥作用，有效地生成pre-miR-18，这可能是由hnRNPA1蛋白能够重新