免疫组化在病毒学中的应用.docVIP

免疫组化法在病毒学上的应用 摘 要: 关键词： 定位准确、形态与功能相结合[1,2]。它将免疫学、组织学、生物化学等学科的理论和技术有机的结合起来[3]。 免疫组织化学技术是用显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术。按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。主要步骤为先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 1.2主要特点 免疫学的基本原理决定了免疫组织化学技术具有高度特异性，因此，免疫组织化学技术从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，所以免疫组织化学技术又具有敏感性高的特点。免疫组织化学技术通过抗原抗体反应及呈色反应，对组织和细胞中抗原的准确定位，使其可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中定位观察，并进行形态与功能相结合的研究。 1.3发展简史 1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。60年代Nakane建立酶标抗体技术标记铁蛋白Ab。70年代Stenberger改良上述技术，建立通过辣根过氧化物酶—抗体过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。80年代Hsu等建立了抗卵白素—生物素（ABC）法之后，免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜检查与诊断技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深大医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。免疫组化的全过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；将显色剂与抗体结合形成标记抗体；标本的制备；免疫细胞化学反应以及呈色反应，观察结果[4-11]。 在鸡蛋白中含有一种碱性蛋白质，分子质量约为68, 000, 属于糖蛋白一类。当是命名为卵白素（Avidin）。卵白素具有4个由128个氨基酸组成的相同亚基，与生物素（又称维生素H）以及其他物质（例如荧光素和酶）具有很高的亲和力。卵白素在一般条件下性质稳定，可耐受80℃两分钟而保持其活性，当与生物素结合形成复合物后，性质就更稳定，可在很大的pH范围内以及对许多蛋白酶都有耐受能力。 生物素（维生素H，Biotin）是Kogl等（1936）首先从鸡蛋黄中分离出来的。它还广泛分布于动植物组织中，并以辅酶的形式参与各种羟化酶反应。生物素为一种较小分子量的维生素，其分子量约为244，它与卵白素之间具有高度亲和力，较之抗原与抗体的亲和力高出100万倍，能够彼此牢固地结合而不影响彼此的生物学活性。由于卵白素和生物素之间具有高度的亲和性，生物素可与抗体偶联，不论生物素还是卵白素均能与过氧化物酶结合并不影响酶的活性，这样就将亲和化学和免疫细胞化学结合起来而形成卵白素—生物素免疫染色技术。 卵白素—生物素过氧化酶复合物（Avidin-biotin peroxidase complex,ABC）技术是由1981年Hsu等在LAB和BRAB的基础上，改良进行建立的。现将卵白素和生物素偶联的过氧化酶按一定的比例组合成卵白素—生物素过氧化物酶复合物，从而保证卵白素有一定的游离结合点让生物素偶联物质结合。由于一个卵白素分子具有可与生物素结合的4个位点，其中一部分可与生物素标记的过氧化物酶结合，另一部分具有可与生物素标记的免疫球蛋白反应，生物素通过氨基与抗体或过氧化物酶相结合，一个过氧化物酶或免疫球蛋白可以结合多个生物素分子，从而增强了免疫球蛋白或过氧化物酶结合卵白素的能力，这样卵白素就可以作为桥梁