RT-PCR课件课件.pptVIP

一、定义 二、逆转录 过 程 试管内逆转录反应 First strand cDNA synthesis反应体系的基本成分 随机引物法是三种方法中特异性最低的 引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。 Oligo(dT)比随机引物特异性高 它同大多数真核细胞mRNA 3‘端的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。 三、聚合酶链式反应--PCR 一种将微量的目的DNA片段在体外快速、大量 扩增的技术。 以目的DNA（待扩增DNA）分子为模板，以一 对分别与模板3’末端互补的寡核苷酸片段为引物， 在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着 模板链延伸直至完成2条新DNA链的合成。不断重复 这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。 PCR 反应体系的基本成分 PCR 反应的条件 RT-PCR应用 获得目的基因（编码蛋白） RNA定性及半定量分析 实验内容RT-PCR扩增小鼠肝组织β-actin基因 一、RNA的提取 RNA质量的高低影响实验的成败。 RNA完整性：RNA酶（RNase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶广泛存在，且非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。因此，RNA提取时最需要注意的是RNA酶的失活处理。 防止DNA/蛋白质的污染 处理方法 RNase广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。 RNase 的又一污染源是移液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。 玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。 枪头、Ep管等塑料制品 RNase-free的枪头与Ep管（贵） 处理：DEPC-H2O浸泡 在玻璃容器中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05% -- 0.1%（DEPC-H2O），37℃过夜。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用） 将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。 将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。 将DEPC-H2O高压处理。 抽提方法：TRIzol TRIzol 是一种新型总 RNA 抽提试剂， TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 8－羟基喹啉，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制 异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质， 并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速 与核酸分离。 β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。 实验步骤 注意事项 TRIzol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，操作时注意。 操作过程中RNase污染的主要来源是手和空气中的浮沉，注意配带手套，迅速操作，管盖盖严；点酒精灯。 细胞裂解必需充分。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质 裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 吸取上清时，宁少勿滥（防止DNA/蛋白质污染）。 二、逆转录-PCR 两步法 RT与PCR分开进行 各自在最优化的条件下进行 两步法通常是取第一步反应 产物的1/10进行第二步反 应，使得其灵敏度不如一步法 高。 多个基因的RT-PCR 一步法 RT与PCR同时进行 RT 和PCR 都不能在最佳条件 下进行并且容易相互干扰 简便操作、减少污染的可能性 由于得到的全部cDNA产物都一 起经PCR扩增，使得一步法的灵 敏度更高 一步法反应体系—Tian