月季花药的培养.pptxVIP

课题2 月季的花药培养知识回顾单倍体育种的过程？正常植株（2N）花药离体培养（N）单倍体植株（N）秋水仙素处理，使染色体翻倍植株（2N）特点：1 明显缩短育种年限2 后代植株都为纯合子。一、被子植物的花粉发育花丝雄蕊花药：囊状结构，内有很多花粉单核小孢子四分体双核减数分裂 花粉母细胞（小孢子母细胞）1个小孢子4个小孢子（单细胞花粉粒）有丝分裂 花粉粒（双核）花粉发育过程：减分4个小孢子(小孢子四分体)（n）1花粉母细胞（2n）有分单核靠边期（n）单核居中期（n）1个花粉管细胞核（n）有分1个生殖细胞核（n）2个精子二、产生花粉植株的两条途径取决：培养基中的激素种类及浓度配比体细胞胚（胚状体）： 在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为体细胞胚（胚状体）。胚状体发育途径:通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养愈伤组织发育途径水稻花药培养接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株三、影响花药培养的因素①选材不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。选材是否成功是花药培养成功的关键。②选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。③花药培养时期的选择一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期。④其它时期选择的缺点选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。⑤单核期花药的挑选为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾。盛开的或略微开放的花，都不宜选作实验材料。⑥选择完全未开放花蕾的原因 完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒⑦为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？ 花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。 ⑦花药培养时间一般月季的花药培养时间选在5月初到5月的中旬，即月季的初花期。初花期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，可提高花粉的诱导成功率。（一）材料选取四、实验操作1、从花药看：月季的初花期 从花粉看：单核期 从花蕾看：完全未开放的 2、通过镜检来确定是否处于适宜的发育期。 方法：醋酸洋红法(将染色体染成红色) 焙花青-铬矾法(花粉细胞核染成蓝黑色)。 花药（载玻片上）→1%的醋酸洋红1滴→用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成红色） 花药（在卡诺氏固定液中处理20min）→取出，置于载玻片上→焙花青－铬矾溶液染色→盖上盖玻片→镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）（二）材料的消毒1、花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30秒2、无菌水清洗3、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分4、放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4分钟（质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）5、无菌水冲洗3～5次 花药的外面有花萼、花瓣保护，通常处于无菌状态（三）接种和培养1、剥取花药在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药注意：①勿损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织。②要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。2、接种立即将花药接种于培养基上，通常每瓶接种花药7-10个。3、培养①培养条件：温度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 ②培养：一般经过20-30天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。③注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。4、鉴定和筛选在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是营养细胞核和生殖细胞核融合造成的）。课题成果评价选材是否恰当 选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会 通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。无菌技术是否过关 如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。课题成果评价接种是否成功 如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。