肺癌NTRK1融合基因研究进展.docVIP

肺癌 NTRK1 融合基因研究进展 (2014-10-11 14:40 来源：丁香园 作者：doctorwolf) 我们在存在 NTRK1 激酶结构域的肺癌组织中鉴定了新型的基因融合状态，NTRK1 基因能够编码高亲和力的神经生长因子受体（TRKA 蛋白）。MRRIP-NTRK1 及 CD74-NTRK1 融合都可以导致结构性的 TRKA 激酶活性的改变，从而发挥癌基因的作用。采用 TRKA 激酶活性抑制剂来治疗表达 NTRK1 融合基因的细胞，可以有效地抑制 TRKA 的自主磷酸化过程及细胞生长。我们在 91 例未知癌基因突变位点的肺癌患者中的其中 3 名患者组织中，采用二代测序的方法及免疫荧光原位杂交的方法有效地证明了 NTRK1 基因融合的存在。 采用口服活性激酶抑制剂克唑替尼或厄洛替尼、吉非替尼等在分别有着 ALK 基因融合或 EGFR 突变的患者当中的效果优于标准方案的化疗。其他的癌基因，包括 ROS1、RET、FGFR1、FGFR2 和 FGFR3 基因融合也在肺癌当中得到了验证，证明了靶向治疗在治疗干预上非常大的潜力。这些癌基因也同样发生在几种其他类型的恶性肿瘤当中，于是这类研究可以将靶向治疗拓展到其他肿瘤治疗的领域当中。 我们发现在 36 个患者当中，2 例存在着框架内的基因融合，这两例都是女性不吸烟腺癌患者，肿瘤组织都存在 NTRK1 基因激酶结构域，可编码 TRKA 受体酪氨酸激酶，但是没有其它潜在的癌基因突变。我们采用 RT-PCR 及全 cDNA 克隆的方法确认了外显子和 mRNA 的表达状态。 在第一例患者组织当中发现，肌球蛋白磷酸化酶-Rho 交互蛋白（MPRIP）的 5’端被连接至 NTRK1 的 3’端。MPRIP 参与了肌动蛋白细胞骨架的调节，这与肺小细胞癌的某种基因融合状态有一定的关系，可以推断它可能导致 TP53 的早期终止。在存在外源性 MPRIP-NTRK1 cDNA 表达的 293T 细胞中我们发现了这种 RIP-TRKA 融合蛋白的表达（由 MPRIP-NTRK1 编码），这是一种恶性胸膜转移的标本，同时这个患者的肺癌组织起源细胞（CUTO-3）我们也进行了细胞培养。 CUTO-3 细胞正是包含这种之前未定义蛋白 MPRIP，这个蛋白在关键性分子 TRKA 酪氨酸残基中具备着自主磷酸化的能力。MPRIP 有着 3 种卷取螺旋域（CCDs），其中一种可以介导肌球蛋白磷酸化的相互作用。ALK、ROS1 和 RET 融合基因的伴侣经常包含 CCD，被认为有着介导二聚体形成和催化随后激酶结构域活性的作用；于是，很可能包含着 MPRIP-NTRK1 的 CCD 都有着相似的功能。第二例患者组织内存在 CD74-NTRK1 基因融合。CD74 编码主要的组织相容性复合物（MHC）二型恒定链，是一种已知的激活 ROS1 的融合伴侣，同时 CD74-TRKA 蛋白的融合被推测定位在细胞膜上。 我们采用了一种免疫荧光原位杂交（FISH）的方法来检测 NTRK1 基因内染色体的重排。这些探针的杂交显示出包含着 MPRIP-NTRK1 或 CD74-NTRK1 基因融合患者组织中 5′及 3′端明确的分离，但是从这些样本的非肿瘤细胞或者对照组织中却没有这样的现象（图 1）。NTRK1 和 TPM3、TFG 或 TPR 之间的融合状态在之前的研究中，证实结肠癌和甲状腺癌中都有存在。尽管 TPM3 定位在 NTRK1 的近端，FISH 也可在包含 TPM3-NTRK1 融合的 KM12 结肠癌细胞系中检测到 5′及 3′端的分离。 采用这种 FISH 检测手段，56 例未检测到癌基因突变的患者进行了 NTRK1 基因重排的筛查，其中 1 例检测到阳性并且最终被证实存在基因融合状态。定量 PCR 证实了 NTRK1 激酶结构域的高表达存在于已知 NTRK1 重排的肿瘤组织中，或 KM12 细胞系中。从癌症基因图谱的转录组分析中，发现 230 例肺腺癌组织中并未检测到 NTRK1 的融合。近期一项 87 例肺腺癌组织的转录组分析，鉴定了一系列之前未定义的基因融合，却不包括 NTRK1 癌基因的融合状态（J.-S. Seo，首尔大学医学院）。 为了正式证实这些突变是致癌性的，我们在其他 3 种常用的评估致癌能力的非肿瘤细胞系中过表达了 MPRIP-NTRK1 和 CD74-NTRK1 cDNA 结构，它们分别是 293T 细胞，NIH3T3 纤维母细胞及 Ba/F3 细胞，并且通过它们来评估融合基因致癌的特性。我们观察相应大小的嵌合蛋白的表达以及 TRKA 的自主磷酸化过程，就像在 CUTO-3 中所看到的那样（图 1c 和 2b）。 图 1. NTRK1 融合基因的发现和验