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第十一章 基因工程 人工接头连接 SV40 病毒的基因组是共价封闭环状双链DNA，长5．2kb。基因组在功能上分为早、晚期转录两个区域。 pCAT－basic plasmid在SV40的调节片段上游插入一个氯霉素乙酸基转移酶（chloramphenicol acetylfransferase， CAT） 11.4获取目的基因的方法 11.4.1鸟枪法 在基因组DNA文库中筛选出目的基因 鸟枪克隆法在基因组DNA文库中筛选到的目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因表达的调控分析。因为有内含子的存在，这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达。 11.4.2化学合成基因 将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段 。 11.4.3聚合酶链式反应 polymerase chain reaction， PCR优点很多，具有快速、灵敏、简便，特异等特点。 PCR对 DNA模板的质量和数量要求比其他实验方法低得多 但PCR也有缺点：扩增DNA的长度一般不超过 2kb， Taq DNA聚合酶在合成作用时也会发生错误，出错率0．25％，费用比较昂贵。 11.5 DNA体外重组与基因转移 11.5.1体外重组 将目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。 粘性末端连接 ①同一限制酶切位点连接 ②不同限制酶切位点连接这两种方法 * * 本章重点 基因工程的概念和一般操作流程。 基因工程工具酶、载体、目的基因获得方法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛选等。 动物克隆技术与转基因技术 11.1基因工程概述 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 基因工程概述 基因工程的基本流程 目的基因获得 重组DNA分子构建 导入受体细胞 转化体细胞扩增、鉴定与筛选 11.2 工具酶 11.2.1限制性内切酶 识别双链DNA中特定序列并切割双链DNA的核酸内切酶。 Ⅰ型和Ⅲ型限制酶的切点不固定，不能产生可以利用的DNA片段，只有Ⅱ型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的限制酶都是Ⅱ型限制酶。 限制性内切酶1 II限制性内切酶基本特征 特异性位点切割双链DNA 识别序列为4-6个碱基，大多双重交替对称 切割产生平头末端(blunt end/flush end)和粘性末端(cohesive) 限制性内切酶2 EcoR l识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子： 限制性内切酶3 BamHⅠ识别6个核苷酸的序列，在特定的A-A之间切割DNA分子 限制性内切酶4 有少数限制的酶在双链DNA的对称轴处切割，产生平齐末端（平端），如BalⅠ和SmaⅠ 限制性内切酶用途 产生特异的限制酶片段； 建立DNA分子的限制酶图谱； 构建基因文库 用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重组 11.2.2. DNA聚合酶 DNA聚合酶种类 ①大肠杆菌聚合酶Ⅰ（全酶） ②大肠杆菌聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） ③T4噬菌体DNA聚合酶 ④T7噬菌体聚合酶及经修饰的 T7噬菌体聚合酶（测序酶） ⑥末端转移酶 ⑦逆转录酶 ⑤耐热 DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） DNA聚合酶种类 DNA聚合酶用途 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） ①用切口平移方法标记DNA（可作杂交探针） ②利用其5-3’外切核酸酶活性降解寡核着酸作为合成cDNA第二链的引物 ③用于对DNA分子的3’突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析 用途 Klenow片段 ①补平限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端； ②用[32P]补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记； ③对带3’突出端的DNA进行末端标记； ④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链； ⑤在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA； ⑥应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序 用途 T4噬菌体DNA聚合酶 ①补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3’凹端 ②对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记 ③标记用作探针的DNA片段 ④将双链DNA的末端转化成为平端 ⑤使结合于单链DN