Transell趋化实验.docVIP

地区： 上海 简介： 在A549细胞中过表达human Oct-4基因，通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。 提供商： oobio 服务名称： 细胞侵袭 侵袭小室实验 摘要：在A549细胞中过表达human Oct-4基因，通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定，研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。关键词：Oct-4，Transwell， A549，细胞迁移 一、?实验原理 Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。肿瘤迁移实验：研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。肿瘤侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。 二、?实验目的 用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析，考察基因Oct-4对A549细胞的迁移能力产生的影响。 三、?实验步骤 实验共分以下4个主要步骤： 1.?质粒转染细胞：准备A549细胞，转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后，按照转染试剂说明书转染细胞（8μg质粒，20μl lipofectamine 2000转染试剂） 。 2.?Transwell铺板；a)?转染12h后，胰酶消化，收集细胞： 细胞计数后，每个样品准备1×106 cells/mL。b)?1,200rpm×5min 离心后，重悬浮于1mL无血清培养基。c)?湿润小室： 将300μL预热的无血清培养基加入到小室中，常温放置1~2h，将ECM膜湿润d)?将小室中的培养基去掉，24孔板中，没有小室的孔中加入500μL含10%血清的培养基e)?用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中，尽量避免产生气泡f)?每个样品取300μL，加入到小室中，即3×105 cells加入到小室中，37℃，5% CO2培养箱中培养?3.?细胞培养及染色；a)?培养箱中培养72h后，取出小室b)?用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉c)?24孔板中，没有小室的孔中滴入15滴染色液（约500μL）d)?用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中，尽量避免产生气泡e)?常温放置20min，进行染色f)?用去离子水洗3-5次，将背景洗掉g)?小室内边缘残留的细胞会影响实验结果，用棉棒擦干 4.?统计分析。显微镜下拍照，使用Image-Pro Plus软件进行细胞计数。 四、?实验结果 ????????????????????????????????????????? ???? 图1. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响 从左开始依次为A549空细胞组，NC对照组（过表达EGFP），实验组（过表达Oct-4-EGFP），每组实验均重复3次 ??????????????????????????????????????????????????????????????????? ?图2. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析 **表示p0.01结论：从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现，A549细胞在过表达Oct-4-GFP 72h以后，迁移能力均高于空细胞组以及对照组（p0.01）。 五、?参考文献 1.?Koch KR, Zhang CO, Kaczmarek P, Barchi J Jr, Guo L, Shahjee HM, Keay S. The effect of a novel frizzled 8-related antiproliferative factor on in vitro carcinoma and melanoma cell proliferation and invasion. Invest New Drugs. 2012 Oct;30(5):1849-64.、2.?Carmon