G50固定化条件优化及载体稳定性测定实验设计方案.docVIP

G50固定化条件优化及载体稳定性测定实验设计方案 方案主要思路：考察 6种大孔树脂对脂肪酶G50的固定化情况，筛选出 3种较佳载体对脂肪酶G50进行固定化，并对固定化条件进行优化，包括Ph和脂肪酶添加量； 选用载体刚性，球磨机试验两个参数对上述的3种树脂进行稳定性考察，最后选出脂肪酶G50最佳载体。 1.1实验方法 1.1.1采用甘油二酯乳化法测定脂肪酶G50的活力： 在三角瓶中加入甘油二酯乳化液4 mL(其中二酯 1 mL，4%的聚乙烯醇3 mL并于 10 000 rpm下均质 10 min)和pH=5.0的 KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(0.05 mol/L)5 mL，于30°C的恒温磁力搅拌器中预热 5 min，然后加入酶粉10mg，并开始计时，保温反应10min 后立即加入95%的乙醇15 mL终止反应；加入酚酞指示剂，用标定过的浓度约为0.05 mol/L的KOH溶液滴定水解释放出的游离脂肪酸，记录KOH消耗的体积；空白试验是在预热后的反应体系中先加入 95%的乙醇再加入热失活处理过的酶液1 mL(取2 mL的酶液100°C 下加热15 min，冷却至室温后使用)后反应30 min，其他操作同前。 酶活力的定义为：在上述条件下，单位时间内(每分钟)生成 1 μmol 可滴定脂肪酸所需的酶量为1个活力单位(U)。具体计算公式如下： 酶活力计算公式为：酶活力( umol / g / min)= 其中：M1表示反应结束时脂肪酸的量(μmol)；M2表示空白试验中脂肪酸的量(μmol)；V表示加入的酶液质量(g)；t表示反应时间(min)。 1.1.2固定化载体的选择 选用弱极性大孔聚苯乙烯树脂AB-8，非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂XAD1180，聚苯乙烯-二乙烯基苯大孔吸附树脂HP20，聚甲基丙烯酸酯中等极性大孔吸附树脂HP2MGL，苯乙烯型极性大孔吸附树脂DA201为固定化载体，聚乙二烯基苯-丙烯酸酯大孔树脂ECR1030。 1.1.3树脂预处理 称取6种树脂各100 g置于500 mL 烧杯中，加入95%乙醇300 mL 浸泡24 h后抽滤，并用去离子水洗至没有乙醇味；用300 mL的5%HCl 溶液浸泡 4 h，抽滤，用去离子水洗至中性；再用2%NaOH 溶液浸泡4 h后抽滤，并用去离子水洗至中性。 将洗至中性的树脂用pH=5.6 的磷酸盐缓冲液浸泡，隔一定时间抽滤，检测滤液的pH并加入新的磷酸盐缓冲液继续浸泡，直至滤液的pH与缓冲液一致。将滤干后的树脂置于4℃冰箱中保存备用。 1.1.4固定化脂肪酶G50的制备 将0.6g脂肪酶Lipase G50溶解于10mlPH为5.6的磷酸盐缓冲液中，加入2g预处理的大孔树脂于30℃摇床振荡（160r/min）吸附8h后，抽滤回收固定化酶，用同种缓冲液洗涤固定化酶,洗涤过的固定化酶于30℃下真空干燥4（水分含量15%），4℃冰箱保存待用。 1.1.6.2固定化酶酯化活力的测定 脂肪酶酯化活力定义为在标准反应条件下每分钟生成1μmol的丙基月桂酸酯所需的酶量为一个酶活力单位（U）。固定化脂肪酶活力参照诺维信标准分析方法进行。 测定方法：将8 g月桂酸与2.4 g丙醇（摩尔比1:1）加入50 mL锥形瓶中，置于恒温摇床（60 °C，180 rpm）振荡30 min，待月桂酸为液态后，加入0.1 g固定化酶，恒温振荡反应10 min，取样。用气相色谱检测，计算月桂酸酯化率。固定化酶的酯化活力按下式计算： （式2） 式中：X——固定化酶酯化活力，U/g；N——初始加入的月桂酸摩尔数； C——月桂酸酯化率；10——反应时间， min；M——加入固定化酶的质量，g。 固定化酶比酯化活力按下式计算： （式3） 式中：X——固定化酶比酯化活力，U/g；N——初始加入的月桂酸摩尔数； C——月桂酸酯化率，10——反应时间，min；P——加入固定化酶中吸附的蛋白质量，mg。 固定化酶比酯化活力＇按下式计算： （式４） 式中：X——固定化酶酯化活力，U/g；N——初始加入的月桂酸摩尔数； C——月桂酸酯化率；10——反应时间，min；N——加入固定化酶载体质量和吸附蛋白质量之和，g。 1.1.5固定化条件的优化 1.1.5.1固定化pH的优化 树脂加酶量80 mg/g，缓冲液的pH分别设定为 (4.0,4.5, 5.0,5.5, 6.0,6.5,7.0, 7.5)，缓冲液离子浓度为优