4核酸分析(阅读).pptVIP

第四章核酸分析 DNA测序的基本步骤 1) 通过适当的方法制备与待测序DNA模板互补的所有可能的带标记的单链寡聚核苷酸片段； 目前DNA测序中应用最为广泛的获得与待测序DNA模板互补的所有可能的单链寡聚核苷酸片段的技术是Sanger双脱氧法和Maxam-Gilbert化学裂解法。 所以，小分子与核酸相互作用的研究，对于了解核酸的结构和功能，对于控制和改善基因表达，对于阐明药物的作用机理以及对于一些疾病的诊断、治疗均有着很重要的价值。 4.3.1 小分子与核酸的相互作用模式 小分子与核酸的相互作用可分为三种基本形式，即共价相互作用、可逆相互作用及嵌入作用。 共价作用 小分子与核酸的共价相互作用主要是同核酸各种碱基的反应，如亲核反应、亲电反应、加成反应等。目前临床上使用的烷化剂类抗癌药物，它们可以使DNA的碱基烷基化，从而干扰DNA的复制和RNA的合成，因而表现为具有抗癌活性。目前最畅销的顺铂类抗癌药物具有极强的抗癌活性，这主要是由于发生鸟嘌呤N一7位亲电反应，形成了链内和链间交联物，结果大大干扰了DNA的双螺旋结构。 有许多致癌物在代谢过程中会转化为烷基化试剂而使DNA的碱基产生烷基化。在芳香族含氮化合物中最危险的一类是芳环羟氨类衍生物，它们在氨的生物氧化或含氮化合物的代谢还原过程中产生。偶氮类化合物的活化通过第一步还原和第二步氧化实现。在这些致癌物的活化过程中细胞色素C-P450(Cyt C-P450)常常起着非常重要的作用。实验结果表明，低于1?g／g的黄曲霉素可以引发小鼠的肝和肺产生肿瘤。 黄曲霉素的代谢环氧化物与DNA中乌嘌呤的结合 可逆作用 核酸与小分子间的非共价可逆相互作用有三种基本形式，它们是静电作用、与核酸沟区间的作用及嵌入作用。 小分子与核酸的可逆相互作用的三种基本形式 1．静电相互作用(Electrostatic Interaction) 核酸是高度电荷化的聚合电解质，其带负电荷的磷酸骨架可以同阳离子发生静电作用，这种作用对于核酸构型的稳定化是非常重要的。 2．与核酸沟区的相互作用(Groove-binding) 在DNA双螺旋结构中，存在着大沟区和小沟区．它们在电场方面、氢键性质、空间效应及水化作用方面都有很大的不同。许多蛋白质分子及寡聚核苷酸分子主要与大沟区发生作用、而小分子因其分子体积小，主要同小沟区作用。 3. 嵌入作用(Interaction) 一些平面的、带正电荷的芳香族小分子，或者具有其他特殊结构的分子，可以嵌入到DNA双螺旋结构的碱基对之间，这种作用称为嵌入作用 4.3.2 小分子药物与核酸的相互作用 不少药物实际上都是金属络合物，因此，研究核酸与金属络合物的相互作用不仅可以揭示药物的作用机制，而且可以指导更有效地进行新药的设计和合成。 某些具有手性的金属络合物和有机分子能通过氢键、静电引力和范德华力挤压或插入到双链DNA分子的大、小沟中与之结合；而某些具有平面结构的分子能插入到碱基对之间，与DNA形成更复杂的络合物。这样形成的络合物在医学研究和基因表达方面具有重要的意义。 20世纪80年代以来，人们发现某些金属的络合物，如Fe-EDTA，Cu—邻二氮菲(Cu—Phen)和Fe—卟啉等能产生羟基自由基或金属氧化型衍生物，后者进攻核糖和脱氧核糖的C1或C4位，经分子重排导致核酸分子中磷酸二酯键的断裂而使核酸大分子降解。由于这种作用与核酸酶的作用相似，这些金属络合物被认为具有核酸酶活性。由于金属络合物的核酸酶活性的发现，为化学研究及其与生物学的结合和应用开拓了新的领域。例如，序列专一性的人工核酸酶(Sequence－Specific Artificial Nuclease)的研究就是目前化学和生物学交叉研究领域中的一个热点。 所谓序列专一性的人工核酸酶，也称为人工核酸内切酶(Artificial Endonuclease)，指的是末端与金属络合物共价键合的寡聚核苷酸片段。它能与单链的靶DNA按碱基配对的原则进行分子杂交而形成双链区。当有氧化还原剂存在时，与之连接的金属络合物通过化学反应产生自由基，后者进攻相邻的核糖和脱氧核糖．使之发生磷酸二酯键的断裂，而从靶DNA剪切出与之互补的序列。由于金属络合物和寡聚核苷酸都可以人为地设计合成，对于任何一个靶DNA，都能设计合成出相应的寡聚核苷酸的金属络合物，从而使其在预期的位点发生断裂。因此。这方而的研究在基因表达的人工调控中应用具有很大潜力。 寡聚脱氧核苷酸—EDTA—Fe(II)定位断裂DNA的原理 4.3.3 核酸小分子探针的研究 在生物化学相关的研究领域，小分子探针指那些可以探测生物大分子各种信息的一类小分子化合物，这类化合物可以与生物分子发生特