3第三章克隆载体.ppt

基因工程的基本条件 A 用于基因克隆的载体 B 用于核酸操作的工具酶 C 用于基因转移的受体菌或细胞 D 目的基因 3.1.1 质粒的生物学特性 1、自主复制性(Self-replication)； 2、相容性和不相容性(incompatibility) ； 3、可转移性。 3.1.2 质粒的分类 根据天然质粒基因编码的特性分五大类： A、致育质粒（fertility plasmid)/F-质粒：只含有转移基因（tra-)，除了促进接合转移外没有其他功能。 B、抗性质粒（resistance plasmid)/R质粒：含有氯霉素、青霉素或水银抗性基因。如RP4质粒，发现于假单胞杆菌。 C、Col质粒（col-plasmid)：编码大肠杆菌毒素（colicine)，可以杀死其他细菌，如存在于E.coli中的CoE1质粒。 人工构建的质粒据功能及用途可分为六大类： A、多拷贝质粒：复制子经过人工突变，除去控制拷贝数的负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。 B、测序质粒：用于目的基因序列测定。 C、整合质粒：装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上。 D、穿梭质粒：含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制。 E、表达质粒：装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达。 F、探针质粒：筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动子、终止子等。 3.1.3 质粒的选择性标记 1、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr等。 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr or Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。 5）β-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β-半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZα中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β-半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码的5‘-端可允许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大 3、标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞。（检测宿主细胞是否具有对某种抗生素的抗性Ampr ，Tetr ，Kanr ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。（用插入失活双抗生素方法检测或生化标记基因如lacZ检测） 由pBR322改造的大肠杆菌质粒克隆载体 许多大肠杆菌质粒克隆载体都与pBR322的特性和用途非常相似。我们简单介绍由pBR322改造来的3个载体：pBR325 、PAT153和pBR327 。这些载体中，每个载体都有一个附加的特征，使它们在一定的克隆实验中比原来的质粒具有更明显的优点。 pBR325 具有三个可选择的标记 pBR325是一个具有附加DNA-片段的pBR322质粒，这个片段含有一个氯霉素-乙酰转移酶（CAT），它可以使氯霉素失活，使质粒具有抗氯霉素抗性。在这个质粒中CAT-基因