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3）自由基的检测 荧光探针：H2DCF-DA 2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐 （504nm/529nm） 胞外H2DCF-DA------ 扩散入细胞内----- 酯酶脱乙酰----DCF-H(不发光）------ DCF（发光） *样品不能在镜下用汞灯照射 Dihydrorhodamine 123（507nm/529nm） H2rhod123 ---- 被动扩散入细胞内---- 在细胞内被氧化成rod123（发光） 四.细胞膜电位的测量 标记膜电位探针(慢反应）： JC1 510nm 530/590nm Dioc5(3) 548nm 573nm Dioc6(3) 484nm 500nm 快反应探针： Di-4-ANEPPS 496nm 703nm Di-4-ANEPPS 498nm 713nm 细胞膜静息膜电位：-70mV 线粒体膜电位：-150mV 以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针 质膜流动性测定: 细胞膜荧光探针受到极性光线激发后，其发射光极性依赖于荧光分子的旋转，而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性。 膜的磷脂酸组成分析； 药物效应和作用位点； 温度反应测定及物种比较等。 五.笼锁解笼锁的测量 NBD-Ca2+ NBD-IP3 NBD NBD + Ca2+ IP3 紫外光 光活化技术 许多重要的生物活性物质和化合物（如神经递质、细胞内第二信使、核苷酸、Ca2+及某些荧光素等）均可形成笼锁化合物。当处于笼锁状态时，其功能被封闭；一旦被特定波长的瞬间光照射，则因光活化而解笼锁，其原有活性和功能得以恢复，从而在细胞增殖、分化等生物代谢过程中发挥作用。 肌肉生理； 钙和膜电位对神经递质释放的调节作用； 钙振荡的机制； 微管和微丝的动力学。 六．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer) 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。 荧光能量共振转移的条件 两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2 供体与受体的距离在2-7nm 供体的发射波长与受体的激发波长一致 荧光共振能量转移（FRET）技术 FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象，指的是当一个荧光分子（供体）受到激发时，能量像邻近的另一荧光基团（受体）转移的过程。两个荧光基团的距离可以通过FRET的效率来计算。 荧光共振能量转移（FRET）技术 生物大分子结构和功能研究 免疫分析 核酸杂交分析 蛋白质间相互作用研究 r: 分子间距离 R0: 分子间发生50%能量转移的距离 D A r 2R0 D r 2R0 A 检测 以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检 测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出 FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。 应用：检测大分子的相互作用 ? 大分子构象的改变(蛋白) 例：大分子(亚基)的结合与分离 ? 受体与配体的结合 ? 常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP 生物学意义上的共定位（Co-localization），是指两个或多个分子完全处于同一空间位置上。这些分子一般是指蛋白，可以用荧光抗体或探针加以检测。 七.位置相关性 八材料科学研究 Zaslavskaia et.al, Martek Biosciences, MD, June 15, 2001 November 2001; Volume 128 (21): pp 4301-4314. Courtesy: Jose-Eduardo Gomes, University of Oregon, USA Nature, 25 April 2002, pg 854 . 激光扫描共聚焦显微镜现在在世界许多研究机构成为常规仪器。 细菌学 生物化学 细胞生物学 组织胚胎学 食品科学 遗传学 药理学 生理学 神经科学 植物学 病理学 材料科学 四、应用研究方向: 生物化学和生物电化学 纳米材料的组装和生物标记 生物芯片检测 纳米药物 单分子检测 （一）、生物化学和生物电化学 激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于细胞和分子