CNE细胞增殖凋亡检测方法【参考】.docVIP

CNE-2细胞增殖、凋亡检测方法 1. 目的 2. 技术路线 3. 试剂、溶液、耗材、仪器、实验材料 4. 操作步骤： 1). MTT法检测CNE-2细胞增殖步骤：(贴壁细胞法) 1. Fen细胞培养于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，在25cm2培养瓶中生长到接近汇合。用含0.05%胰蛋白酶，0.02% EDTA的PBS消化细胞5分钟，洗涤后，用细胞培养液将细胞配成1×105/ml。 2. 取96孔细胞培养板，每孔加0.1ml细胞悬液，在37℃ 5% CO2的饱和水汽二氧化碳培 养箱中培养24小时，让细胞帖壁。每孔加0.1ml效应细胞悬液，效靶比10：1到50：1，继续培养4小时，让效应细胞发挥杀伤效应。实验中，设立只有靶细胞的无杀伤对照和只有 效应细胞的阴性对照，每种处理设3各复孔。 3. 用含2%小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤各孔 3次，洗去不粘附的细胞。每孔加 0.1ml含2%小牛血清的RPMI-1640培养液和10μl 5mg/ml的MTT染液，继续培养3小时。 4. 用PBS洗涤2次，每孔加0.1ml含0.04mol/L HCl的异丙醇，室温30分钟，溶解形成的结晶。在570nm波长处，用酶联检测仪检测各孔的光吸收值(OD)。杀伤活性(%)=(OD实验孔-OD阴性对照) /OD无杀伤对照× 100。 MTT法应注意事项： 1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT 试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记!否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。 3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就是最好的时间点(因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显)。 4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。 5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。 7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 8.避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 MTT配制： 通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。 MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感;往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。 PBS配方： Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调pH 7.4 定容1L 2). CCK-8法检测CNE-2细胞