DGGE技术及其在微生物研究中的应用.docVIP

变性梯度凝胶电泳 --DGGE 摘要：变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术具有精确、快速、易操作等特点, 能克服传统微生物研究方法的不足1 引言 变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）Fischer 和Lerman[1]于1979 年首先提出了, 并将其用于医学上基因点突变的检测。与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比, 这项技术可以分辨只有一个碱基差异的基因序列。1985年, Myers RM[2]等人首次在DGGE中使用“GC夹板”和异源双链技术, 使该技术日臻完善。1993年，Muyzers[3]等人首先将PCR技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验rRNA的基因,证实了该技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异方面具有独特的优越性。此后的十几年内DGGE技术在研究微生物多样性和种群差异上已成为一种重要工具, 并被广泛用于活性污泥、池塘底泥、污染土壤、海洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道中的微生物多样性检测和种群演替的研究。 2 基本原理 PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯酰胺凝胶中添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。电泳时，DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。当DNA双链完全分开时，其电泳速率急速下降。由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。理论认为, 只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、温度等足够精细, 有一个碱基差异的DNA片段都可被分开，在不同泳道中停留在相同位置的条带, 一般可视为具有相同的DNA序列。 为了使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果, 须先选择所研究的DNA范围及电泳过程中所需的变性剂浓度梯度。由于DNA解链温度的升高时迁移速率的变化不明显，难以将野生型和突变型DNA分开，所以高温解链区的突变往往难以检测[11]。而且，高温解链区的解链时间较长，也限制了DGGE的使用。解决的办法是在DNA片段上连接一段长度为30~ 50bp富含GC的核苷酸序列, 该序列被称为GC 夹板(GC- clamp)。在DGGE分析过程中形成一个人工高温解链区，使DNA片段的其他部分处于相对的低温解链区，从而易于分析。 3 技术步骤： (1) 样品总DNA 提取 (2)样品16SrDNA片段的PCR扩增 (3)DGGE 条件优化与分析 (4)割胶测序等后续分析。 3.1 样品总DNA提取 群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础，样品中细菌种类复杂且混杂有大量有毒物质, 如何使所有细胞裂解、充分释放DNA、有效去除杂质, 建立高效、可靠的DNA提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超声波法、基于SDS的裂解法、改进的化学裂解法、微波法、冻融+ 玻璃珠+ 溶菌酶+ SDS和DNA试剂盒法等6种DNA提取方法。 3.2 样品16SrDNA片段的PCR扩增 PCR扩增是PCR- DGGE技术中至关重要的步骤。PCR全过程包括三个基本步骤: 变性、退火、延伸。反复进行变性、复性和延伸的循环,从而使扩增DNA 产量呈指数上升, 经25 ~ 30个循环后, 扩增倍数可达106倍。 在多重PCR中很容易产生PCR偏差和PCR假阳性,这样就不能真实客观地反映微生物群落的多样性, 甚至显示实际上并不存在的微生物信息。下面就简要介绍一下常见的PCR偏差和PCR假阳性及其排除方法。 由引物与模板的退火温度引起的PCR偏差。在多重横板PCR中, 引物不可能与所有的模板序列都完全互补, 两者之间会有一个或几个碱基的错配, 大大降低了这类模板的扩增效率, 这样就会产生严重的PCR 偏差。排除这种PCR偏差的方法是适当降低退火温度或使用简并引物。在PCR最终产物中, 不同序列浓度趋于1B1, 掩盖了模板起始浓度的差异。这是由于起始浓度低的模板经扩增后其PCR产物又作为模板继续扩增, 且在PCR的最后几个循环其扩增效率高于PCR产物更为丰富的其他序列, 使最终产物浓度趋于1B1。排除这种PCR偏差的方法是减少PCR循环数, 提高从变性温度到退火温度的降温速率。异源DNA序列的产生。这是由于随着PCR 扩增循环数的增加, 产物浓度逐渐增高, 引物逐渐减少, 异源单链DNA分子退火的可能性大大增加, 从而产生异源DNA分子。在DGGE 电泳中, 就会产生多余的条带, 得出错误的关于微生物群落多样性的结论。排除这种PCR偏差的方法是