高效液相色谱操作规范.docVIP

高效液相色谱 简介 仪器型号：Agilent 1200 HPLC高效液相色谱安捷伦??流速范围：0.001~5.0mL/min,?0.001mL/min步进压力范围：?0-40?MPa?(0-400?bar,?0-5880psi)梯度组成精密度：0.15%?SD?（1mL/min）二、实验原理 分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。 C18柱-反相HPLC（reversed phase HPLC）： 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。 检测器（FLD） Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。 、实验步骤 待测样，准备所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。开机。打开电脑、各组件电源、打开软件。配置仪器 打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。排气：阀，，点击“”选项，进入泵编辑画面，设：3-5ml/min，点击“OK”。 点击“ ”图标，则系统开始，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止切换通道（A-B-C）继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。点击“ ”图标关泵。阀 装色谱柱 如果别人的色谱柱未卸下，要小心卸下，把两端用白色的螺帽旋紧。 先把四元泵打开，要液体从连接色谱柱前端的线路中流出后，再接色谱柱。连接时要确认色谱柱上流动相水流方向，切勿接反。如果有保护柱，应该分段连接。两端接上后，先打开泵小流速过柱0.5ml/min。在不漏的前提下，逐渐升高流速，直至你分析时需要的流速。 色谱柱上卸下来的白色螺帽放置在柱温箱上面一格内。 编辑方法及样品分析 方法信息：从“”菜单中选择“” 点击“Ok”，进入下一画面。。点击“Ok” 进入下一画面。 自动进样器参数设定:选择合适的进样方式, “”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“”---可以点击“ ”键进行进样程序编辑。点击“Ok”进入下一画面。 泵参数设定：（以四元泵为例）在“”处输入流量,如1.5ml/min ， 在“Solvent B”处输入70,(A=100-B-C-D) ,也可”时间表”，编辑梯度。在“”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。点击“Ok”进入下一画面 柱温箱参数设定:在””下面的空白方框内输入所需温度,并选中它。 DAD检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域 。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit-狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。 FLD检测器参数设定: A: 激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。: 发射波长: 280-900nm, 步长为1nm 序列的编辑 序列参数信息：从“”菜单中选择“” 保存路径，子目录改为自己的文件夹；关机菜单处，选中后序列命令/宏，下拉菜单中选择STANDBY。 序列表的编辑：从“”菜单中选择“”，建立自己的序列表，整个序列表一般包括测试前洗柱子，走基线，测试样品，测试后洗柱子几个部分。 通过追加行和插入增添列表个数。进样次数/瓶 1；样品瓶按放置样品次序。试前洗柱子，测试后洗柱子样品瓶不用填写。进样次数填写“1”。 序列表建立完成后，点击运行序列，运行该序列，等仪器显示ready，样品自行进行测试。 数据分析 从“”菜单中，点击“”进入数据分析画面。 从“”菜单选择“”， 选中您的数据文件名， 则数据被调出。 如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。 关闭Agilent 1200各模块电源开关。 Agilent 1200 LC维护保养： 色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。 流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。 溶剂不能干