5--1DNA的粗提取与鉴定解析.ppt

* 专题5 DNA和蛋白质技术 一、基础知识 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2.提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 1、 DNA和蛋白质等在不同浓度的NaCl溶液中溶解度有何特点？ （一）DNA的溶解性 2、分离原理 当NaCl的物质的量浓度为0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 （1）DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些物质则可溶于酒精。 3、DNA在酒精溶液中的溶解性 （2）提纯的原理： 将DNA与蛋白质进一步分离 （二）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶:水解蛋白质，对DNA没有影响。 ② 高温:大多数蛋白质不能忍受60－80°C，而DNA在80°C以上才会变性。 ③ 洗涤剂:溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响。 试剂： （三）DNA的鉴定 条件： 二苯胺 沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。 沸水浴 现象： （一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定 二、实验设计 二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 （一）实验材料的选取 思考:原则上选什么材料？为什么？ (1)选择含有DNA的生物材料 (2)选用DNA含量相对较高的生物组织， 成功的可能性更大 动物细胞，例如:鸡血细胞溶液 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、选动物细胞还是植物细胞？为什么？ 答：水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。搅拌的作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 讨论1：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？搅拌的作用？ 破碎较易 加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。 2、方法: 植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜。 3、植物细胞和动物细胞提取DNA的区别 讨论2：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？ 答：洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放； 食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 讨论3：如果研磨不充分， 会对实验结果产生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 方案一: 【重点掌握每一步的作用】 DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同 在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，作用 加蒸馏水 调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，作用 再用2mol/LNaCl溶液，作用 原理： 溶解DNA、除去不容杂质 析出DNA 溶解DNA （三）去除滤液中的杂质（三个方案） （三）去除滤液中的杂质（三个方案） 讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。 讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 （四） DNA的析出与鉴定 1、DNA的析出 加入何种溶液？ 出现什么现象？ 与滤液体积相等冷却的酒精（体积分数为95 ％） 白色丝状物 加入酒精的目的： 使DNA丝状物析出，提取含杂质较少的DNA。 1.抑制核酸水解酶的活性，防止DNA分解 2.对DNA的凝集效果较好 3.增加DNA分子的柔韧性，减少断裂 2、 DNA的鉴定 (1) 两支试管中分别加入 2mol/L NaCl溶液5ml （目的是什么？） (2) 其中一支试管中加入DNA丝状物 (3) 各加入二苯胺试剂4ml (4) 混匀后，置于沸水浴中加热5min (5) 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化 (6)观察现象： 溶解丝状物的溶液变为蓝色 概括提取DNA的实验步骤 2.破碎细胞，获取含DNA的滤液（动植细胞分别加什么） 1.选取实验材料 3.去除滤液中的杂质（方案一：如何操作） 4.析出DNA（如何操作） 5.鉴定DNA（试剂、条件、现象） 观察你提取的DNA颜色，如果是白色说明什么？不是白色丝状物又说明什么？ 二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色说明什么， 四、课题成果评价 DNA中的杂质较多 可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备 课堂练习57页(操作提示） 第一步是材料的选取 选取DNA含量较高的生物材料， 第二步是DNA的释放和溶解 这一步是实验