植物五种酶活性检测方法.docVIP

选择茶树不同品种，每个茶枝接种5头叶蝉，按不同的时间点 0h/6h/12h/18h/24h/36h/48h/72h/96h 取样，每个样品重复三次，测定PPO/POD/PAL/CAT/LOX 五种酶活。 1、多酚化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定酶活性单位苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定290nm处吸光度变化0.01OD为一个活力单位。 3、脂氧合酶 linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX 活性的测定Lox酶活性单位以每分钟在234nm处吸光度变化0.01OD作为一个活力单位。 4、过氧化物酶（PDA）的活性测定（愈创木酚法） 取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP[聚乙烯吡咯烷酮POD （ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） u/g?min ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重 g ；t为反应时间 min ；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。 5、过氧化氢酶（Catalase CAT）活性测定 取0.5克剪碎叶片于预冷研钵中，加入5ml的提取介质0.05mol/L PH7.8的磷酸缓冲液（含1%PVP）（先加3ml研磨，再加2ml冲洗研钵），研磨匀浆，转入离心管后于冰箱中冷提12h。1000r/min离心20min,得到酶初提液。 取200ml PBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092ml 30%的H2O2（原液）摇匀即可。 取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（紫外）。（测定30s读数一次，5分钟）。 酶活性计算：以每min OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。 CAT [ΔA240×Vt ]/（W×Vs×0.01×t） u/g min ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重 g ；t为反应时间 min ；Vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。