基因克隆步骤完整版.docxVIP

1总RNA提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4oC，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4oC，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4oC，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80oC保存。 此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。 2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5× gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42oC，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ 1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液 10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为： (1) 37oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保存。 3 PCR 按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下： Premix Taq 25 μL 模板 5μL 引物1 (10 μM) 1 μL 引物2 (10 μM) 1 μL ddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。 PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。 4 基因克隆及测序 4.1 PCR产物切胶回收 将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割胶回收试剂盒进行纯化，步骤如下： (1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500μL平衡液BL，13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中； (2) 按100 mg agarose胶加入100μL 溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混匀几次，至胶完全融化； (3) 将样品倒入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中； (4)向吸附柱CB2中加入600μL 漂洗液PW（加乙醇），室温下13,400×g离心1 min，倒掉收集管中的废液，吸附柱CB2重新套回收集管中； (5) 重复上一步骤； (6) 将吸附柱CB2放入收集管中，室温下13,400×g离心2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干； (7) 将柱子套入一新的灭菌1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL 洗脱缓冲液，室温放置2分钟，13,400×g室温离心2 min，收集到的洗脱液即为回收的DNA纯化液； (8) 取5μL的纯化液体进行1%琼脂糖凝胶电泳，以检查纯度，并测量溶液中DNA含量。 4.2目的片段与载体连接 (1) 胶回收产物与T载体连接体系，参考Takara公司pMD18-T载体的试剂盒说明书。在灭菌的0.5 mL 离心管中配制如下溶液（10 μL）： 回收DNA 4μL Ligation Solution 5μL pMD18-T Vector 1μL (2) 16oC反应30分钟，所得产