地高辛標记探针的Southern印迹方案.docVIP

地高辛标记探针的DNA印迹方案 Southern blot using DIG Prober (分子生物学实验室) Step I 采用地高辛高效标记混合物(ROCHE) 标记DNA探针 1 以质粒为模板，PCR扩增序列特异性片段，回收片段，并测定浓度 浓度测定：将回收产物取1μl稀释5倍，标准分子量的标记物MAKER分别点1μl，2μl，4μl，6μl.然后比较回收产物的条带亮度与MAKER比较后，可以粗略估算浓度。 2 取1μg模板（第1步扩增回收产物）于1.5ml的eppendorf管中，加入灭菌双蒸水至终体积为16μl。 3 沸水浴处理10min后迅速于冰上冷却使DNA变性 摇匀DIG-High Prime（vial 1），取4μl加入已热变性的模板DNA中，混匀后，瞬时离心，37℃保温20h，65 4取１μl电泳检测，标记后的条带稍大于标记前片断。 ５标记好的DNA探针－20℃ Step II 基因组DNA酶切 1 提取高质量的基因组DNA，浓度1μg/μl ; 测定浓度的方法同测定探针浓度方法一样。 2 选择合适的内切酶（酶切的DNA量20μg左右。注意考虑到纯化的损失，约30%，酶切DNA浓度过大时，可以考虑多做几管做浓缩）。 50μl酶切反应体系： EcoR I (15U/μl ) 5μl 10×M buffer 5μl gDNA 10μl（约10-20μg） ddH2O up to 50μl 注：有些内切酶需加BSA，请参照内切酶说明（包括最适酶切温度）。 3 37℃酶切12h （电泳检测），视酶切情况可延长酶切时间，直至酶切完全。65 Step III 预电泳和电泳 1 配制0.8 %的琼脂糖凝胶（大胶40ml左右，胶薄较好，利于转膜）。 2 加入适量上样缓冲液（Loading Buffer）点样，点上质粒做对照。 注：两边的点样孔尽量空出来；点上marker,再单独一点样孔用溴酚兰做指示，防止跑过。 120V， 5min；40V，4h。溴酚蓝前沿跑至胶边约1厘米处即可。 Step IV 转移胶处理与转膜 电泳后用EB染色，紫外光下拍照，然后，切下marker和右上方一角。 1 凝胶在灭菌的双蒸水中漂洗片刻。 2. 室温下凝胶在0.25M HCl中浸泡15min，使DNA脱嘌呤，摇床上缓慢摇动， （溴酚蓝由蓝色变为黄色）灭菌的双蒸水中漂洗凝胶。 3 凝胶转移到10倍于凝胶体积的变性液（1.5M NaCl，0.5M NaOH）中轻轻振荡20min；换液一次，继续漂洗20min。 4 灭菌的双蒸水漂洗凝胶片刻，然后置于10倍于凝胶体积的中和液中轻轻振荡20min，换中和液重复一次。 换培养皿，用20×SSC转移缓冲液漂洗一下 仪器：大培养皿3套 换洗过程很重切记清顺序 Step V 转膜 1 将尼龙膜漂浮于超纯水中至完全浸润，转移至20×SSC转移缓冲液中浸泡15min。先尼龙膜再倒水和缓冲液，保证完全浸润。 2 组装转移装置：玻璃板+滤纸桥(边缘完全充分浸入20×SSC转移缓冲液)+1张滤纸+凝胶(背面朝上)+尼龙膜（做好标记）+滤纸（3层）+吸水纸+玻璃板+500g重物（如下图） 方向 注意每层都要用玻棒排净气泡。 3 毛细转移装置如图。在20×SSC转移缓冲液中毛细转移24h，为提高转膜效果可以适当延长时间；转膜期间经常更换吸水纸及加液（注意防止短路！！：用封口膜在四周封好，防止膜上吸水纸接触到膜下缓冲液）。 4 转膜结束后，凝胶拍照检测DNA残留状况。 5. 取膜，（用铅笔标记样品孔的位置，切角标示方向） 毛细转移法具体步骤：1． 20×SSC浸湿一张whatman 3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”。2． 凝胶反放在浸湿的whatman 3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。3．用塑料膜包裹膜的边缘，照凝胶的大小剪一张尼龙膜。4．膜（20×SCC平衡过）放在凝胶上。5． 尼龙膜上放一张whatman 3mm滤纸、一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。6．20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。 Step VI 固定，预杂交，杂交 1 将尼龙膜浸入6×SSC溶液中2～5min，除去黏附在膜上的凝胶碎片。 2 固定：把膜放在两层干燥的吸水纸中央，80℃ 3 配制地高辛杂交液：用64ml的无菌超纯水分两次加入DIG Easy Hyb Granules（vial 7）中，迅速于37℃振荡5min至溶解。（因为试剂盒中vial 7是用大约75ml左右的小瓶装的，原试剂是冻干粉样，配制杂交工作液需加入6