酶标记抗体的制备技术试卷.docVIP

酶标记抗体的制备技术 （一）酶标抗体的条件 1．纯度高、含杂蛋白少,用IgG优于血清抗体，用Fab优于IgG。 2．特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只有一条沉淀线,与IgG的全血清也只有一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。 3．效价高 一般琼脂扩散鉴定为1︰64以上才算合格。 抗体的可供标记的位点结构图 交联法通常用的交联剂是戊二醛，戊二醛商品大多为25%的水溶液，利用戊二醛分子上对称的两个醛基，分别与酶和蛋白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键结合而进行标记。标记时应尽量采用新鲜纯品，当戌二醛的OD235nm/OD280nm＜3时，即为好的交联剂。 戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 ⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗体一起加入进行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶结合物。由于抗体分子量大(16万)，酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶蛋白分子氨基数多得多，结果生成的抗体－戊二醛或抗体－戊二醛－抗体多而造成酶标物的活性小。 一步法操作： 抗IgG－AKP的制备：将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中缓缓搅拌，尽量避免气泡产生，完全溶解后，缓缓滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最终浓度为0.2%，移至室温中静置2h~3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充分透析或以SephadexG25柱除去过量的戊二醛，4℃保存备用(也可保存于50%甘油中置低温冰箱)； 抗IgG－HRP的制备：将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,缓慢搅拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室温2h~3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分装后保存于低温冰箱，避免反复冻融。或冷冻干燥保存。 ⑵ 二步法： 是先使酶与戊二醛反应,除去未反应的戊二醛，再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基结合，最后加入少量的赖氨酸封闭被戊二醛激活的酶的残基。 二步法操作： 将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温放置18h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反应的戊二醛。 加生理盐水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，混合后4℃冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L赖氨酸，置室温2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，离心去沉淀，上清液即为酶结合物，再进一步以硫酸铵沉淀纯化后应用。 AKP一般不采用二步法,而只用一步法。 改良HRP二步标记法： 取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中，加入25%戊二醛0.1ml，37℃温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2500r/min离心沉淀10min~15min，倾去溶液。 沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。 沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液溶解，加入0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，加KH2 PO4，使近中性即可应用。 2．氧化法 采用过碘酸钠，过碘酸钠是强氧化剂，能将HRP的甘露糖部分(与酶活性无关的部分)的羟基氧化成醛基，然后与抗体的氨基结合,形成酶标抗体 （1）氧化法操作过程如下： 将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混合后，再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4)，置室温中轻搅30min，在溶液呈黄绿色时，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室温中放置1h，使氧化反应中止，然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析，换液3次。 在3ml HRP－醛基溶液中，加入5mg抗体(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中)，室温置2h~3h，加入5mg氢化硼钠(NaBH4)，于4℃冰箱放置3h或过夜，然后用PBS液充分透析，离心去沉淀物。上清液即为酶结合物，纯化后使用。 （2）改良过碘酸钠法： ① 取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水＋128mg NaIO4) 0.5ml，混匀，置4℃30min； ② 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min； ③ 加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓