蛋白质工程与食品产业.pptVIP

蛋白质的生物学功能 总） 氨基酸的结构特征 组成生物体蛋白质的20种氨基酸 2.组成生物体蛋白质的20种氨基酸2 肽（肽键与肽2 肽（肽键与肽3 蛋白质工程流程图 从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应用的氨基酸序列 找到相应的脱氧核苷酸序列 一、??蛋白质的功能与结构 ??蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功能的关键因素是它的分子构象 . 第二节 蛋白质工程的基本步骤与改造策略 一、??蛋白质工程的基本步骤 1 分离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析,得到其空间结构的尽可能多的信息。 （2）对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域。 （3）通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。? ? 第三节 、蛋白质改造方法 第四节 蛋白质工程在食品中的应用 4 围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。 5 对经过改造的蛋白质进行功能性测定. 二、蛋白质工程的改造策略 1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；α螺旋和β折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。 2、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。 ?3、应注意保留潜在的N糖基化位点 Asn-X-Ser／Thr-X-Pro 中的Asn 天门冬酰胺 、Set 丝氨酸 或Thr 苏氨酸 。 4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。?? 5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。 ?6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。 7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为： 初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入 高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接 从头设计合成新型蛋白质 一、?初级改造?? 通过基因突变方法，以达到改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。? 目前，主要采用的基因突变方法： 基因定位突变 盒式突变。 基因定位突变 根据三联体密码，编码DNA（目的基因）的确定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。 这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 基因定位突变的基本过程： 首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统 如大肠杆菌等 即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的基本手段。 （一）M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术? 特点：能够准确按照人们的意图进行DNA突变，即想改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变 基本过程：将待研究的基因插入载体M13，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一个或几个非配对碱基）作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入合适的表达系统合成突变型蛋白质。 （二）?寡核苷酸介导的PCR诱变技术 特点：利用PCR技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率 以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一个或几个非互补的碱基）为引物，直接进行基因扩增反应，就会产生突变型基因。分离出突变型基因后，在合适的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。 过程： 将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各加入两个特定的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变； 两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反应中引物的位置不同，所以PCR扩增后，产物有不同的末端。 将两管PCR产物混合、变性、复性，则每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌后，这两个