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北京师范大学珠海分校 尼龙固定化木瓜蛋白酶 实验报告 小组成员：祝晓晴 孙雪 苏泽宇 邱嘉悦 一.实验原理 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性的载体结合，固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。酶的固定化方法有：吸附法（物理吸附、离子吸附）、包埋法、共价键结合法、交联法。固定化酶的优越性主要表现在：（1）在大多数情况下，可提高酶的稳定性；（2）提高酶的使用效率，降低生产成本；（3）酶不与产品混合，制品易于纯化；（4）利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产。本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键，经 HCl水解后，产生游离的-NH基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛中的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO则与酶中的游离氨基缩合，形成尼龙（载体）—戊二醛（交联剂）—酶，即尼龙固定化木瓜蛋白酶。 二.实验材料、试剂及仪器 3.1 材料 尼龙布 86 或 66 ，100目，剪成3×3cm2。 3.2试剂 1 1 甲醇溶液 含18.6％CaCL2和18.6％水 （每组50mL）：称18.6克CaCL2 溶于18.6 mL蒸馏水，冷却后，用甲醇定容至00 mL。 1 2 3.5mol／L HCl溶液（每组30mL）：取29.2 mL浓HCl，定容至100 mL。 1 3 0.2 mol／L硼酸缓冲液 pH 8.4 （每组30mL）：称取0.858克Na2B4O7·10H2O和0.68克H3BO3用蒸馏水溶解，定容至100 mL。 1 4 5％戊二醛 以0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液配制，每组30mL）：取25％戊二醛20mL，用0.2mo1／L pH 8.4硼酸缓冲液定容至00 mL。 2 5 0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液 （每组250mL）: 称取1.28克Na2HPO4·2H2O和1克NaH2PO4·12H2O用蒸馏水溶解，定容至100 mL。 2 6 0.5mo1／L NaCl溶液〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组150mL）: 称取2.93NaCl，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。 3 7 木瓜蛋白酶溶液 1mg／mL，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕 （每组15mL）：称取100 mg木瓜蛋白酶粉末，加1 mL激活剂，研磨10min,用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。 3 8 激活剂〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制，含半胱氨酸10mmo1／L，EDTA 1mmo1/L〕（每组50mL）：称取0.12克半胱氨酸和0.04克EDTA，用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液溶解，定容至100 mL。 4 9 1％酪蛋白〔用0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液配制〕（每组20mL）。称取1克酪蛋白，加100 mL0.1mo1/L pH 7.2磷酸缓冲液，37℃下保温振荡3h，至酪蛋白溶解。 4 10 20％三氯乙酸 用蒸馏水配制 （每组40mL）：称取20克三氯乙酸，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。 3.3仪器 恒温水浴锅, 紫外分光光度计, 冰箱。 三.实验步骤 4.1固定化酶的制备 每组取5块尼龙布洗净，凉干。用含18.6% CaC12和18.6%水的甲醇溶液在50℃下保温10秒钟左右，并轻轻搅拌至尼龙布发粘，取出用水冲去污物，用吸水纸吸干。 尼龙布用3.5mo1／L HCl在室温水解45min，用水洗至pH中性。 尼龙布用5％戊二醛在室温下浸泡偶联20min。 4 取出尼龙布，用0.1mol／L pH7.2磷酸缓冲液反复洗去多余的戊二醛，吸干，立即用酶液 1mg／mL 在4℃下固定3.5h 酶液用量每块布为1mL 。 5 从酶液中取出尼龙布 保留残余酶液作测定用 ，用0.5 mo1／L的NaCl 用0.1mol／L pH7.2磷酸缓冲液配制 洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。 4.2 酶活力测定 （1）溶液酶活力测定 取0.2mL酶液，加入1.8mL激活剂，37℃预热10min，加入37℃预热10min的1%酪蛋白溶液1mL，准确反应10min，加入20%三氯乙酸2mL反应终止酶反应。对照管先加入20%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液，其它与测定管相同。过滤，清液于280nm波长下测定光吸收值。 在上述条件下 ，每10min增加0.001个光吸收值为1个酶单位（U）（以下同）。 （2）残留酶活力测定 同溶液酶活力测定。 （3）固定化酶活力测定 取一块尼龙布固定化酶，加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。 四.数据处理及计算 活力回收 （固定化酶总活力数