HLA-B27流式检测.docVIP

HLA-B27流式检测 HLA-B27检测的意义 HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibity Complex， MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。根据HLA抗原结构，功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、-DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有关，其中Ⅱ类抗原更为重要；Ⅲ类分子为补体成分。近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。HLA-B27的流式细胞检测方法单克隆抗体和荧光素的开发使得流式细胞仪在各个领域得到空前的发展，多参数同时测定使得流式细胞术得以快速，灵敏，特异地检测某一特定细胞群中某一特异性抗原的表达。用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程度高；灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间，不同仪器之间，不同实验室之间可重复性高。【实验步骤】一、样本的收集和准备 用K3EDTA或heparin或ACD抗凝的真空采血管收集至少1ml的外周血，若不能及时染色，则最好选用ACD或Heparin，因此两种抗凝剂对保存细胞表面抗原之抗原性为保证实验结果的可靠性，持久性较佳。请尽量在采血后24内进行染色，染色前将抗凝血室温放置，无须冷藏。固定保存、冷藏保存的样本和发生溶血的样本都不应该使用。 二、染色和固定 取流式试管，加30ul试剂Anti-HLA-B27 FITC/CD3 PE到试管中； 用微量移液器小心地将50ul充分混匀的抗凝血加到试管的底部，确保WBC的浓度在3.5×103-9.4×103WBC/ul之间，轻轻混匀，室温避光静置15-20； 注意：小心避免血样加到试管壁上，以免血与试剂不能充分接触，静置时避免样本直接光照取出试管，每管加入10倍稀释的Lysing Solution 2ml，轻轻混匀，避光室温静置10-12不要超过12待管内液体透亮然后1200转/min，离心5min，弃上清液注意：溶血时间不应太长，以免破坏白细胞轻轻混匀，重悬细胞，每管中加入2ml PBS，轻轻混匀，1200转/min，离心5min，弃去上清液。每管加入0.3ml PBS混匀，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.3ml 1%的多聚甲醛保存液，放4℃冰箱保存，h内上机检测。上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。 【结果分析】 HLA-B27阳性样本 HLA-B27阴性样本