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提取方法及部位对三裂叶豚草基因组DNA的影响 　　摘要：利用改良的CTAB法、SDS法及斑迹抽提法提取三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）不同部位的基因组DNA。结果表明，改良的CTAB法提取三裂叶豚草韧皮部基因组DNA的提取效果最好。 　　关键词：三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）；提取；基因组DNA；改良的CTAB法 　　中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1447-03 　　三裂叶豚草（Ambrosia trifida L.）为菊科（Compositae）豚草属（Ambrosia）一年生粗壮草本植物，高50～120 cm，有时可达170～200 cm，叶掌状三裂，有时五裂，几乎全部对生[1]。三裂叶豚草原产于北美洲，生命力、竞争力极强，传播途径多，繁殖系数大，分布范围广，危害大，难以治理，对农业生产和生态环境已经造成了巨大危害[2-4]。2011年，本课题组调查时发现三裂叶豚草在辽宁、上海、黑龙江、吉林、北京等省市均有分布，并且在形态上有一定差异。三裂叶豚草分子水平的遗传变异研究可为探索其传播规律与途径提供一定依据。 　　本研究对三裂叶豚草基因组DNA提取方法及不同部位基因组DNA提取效果进行比较研究，为获取更高质量的DNA提供一定参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　三裂叶豚草成熟植株2011年10月采集自沈阳农业大学科研基地，取其叶片、茎、韧皮部、花序轴置于装有变色硅胶的密封袋中，干燥保存备用。 　　1.2 试剂 　　改良的CTAB提取缓冲液[5，6]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.6 mol/L 　　NaCl，2% CTAB；SDS提取缓冲液[7]：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），50 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2% SDS；斑迹抽提缓冲液[8]：10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，2%SDS，0.039 mol/L二硫苏糖醇。 　　1.3 方法 　　1.3.1 样品的处理 称取0.015 g三裂叶豚草干燥叶片，放入研钵中加入石英砂和液氮研磨。将研磨后的粉末转移至2 mL离心管中，分别加入1 mL改良的CATB提取缓冲液和SDS提取缓冲液。斑迹抽提法的样品处理则不需研磨，直接将样品放入2 mL离心管中，加入斑迹抽提缓冲液。 　　1.3.2 基因组DNA的提取 将2 mL离心管放入水浴锅中65 ℃水浴1 h，斑迹抽提法则需水浴3 h；1 200 r/min常温离心10 min取上清；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）混合液，振荡混匀后，1 200 r/min常温离心10 min取上清；加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24∶1）混合液并混匀，1 200 r/min常温离心10 min取上清，重复两次；加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，-20 ℃放置30 min，1 200 r/min常温离心10 min留沉淀；加入500 μL 70%乙醇洗涤3次；干燥2 h后加入100 μL TE缓冲液溶解DNA，放置于-20 ℃保存。试验均重复3次。 　　1.3.3 不同组织基因组DNA的提取 采用改良的CATB法分别提取三裂叶豚草的成熟叶片、茎、韧皮部、花序轴等组织部位基因组DNA，提取方法同“1.3.2”。试验均重复3次。 　　1.3.4 基因组DNA样品质量的检测 用紫外分光光度计检测提取样品的基因组DNA纯度，根据A260 nm/A280 nm判断DNA纯度；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测提取样品的基因组DNA，并用紫外凝胶成像仪观察并拍照记录。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同提取方法提取三裂叶豚草叶片基因DNA的比较 　　用紫外分光光度计检测提取样品的基因组DNA纯度，根据A260 nm/A280 nm来判定DNA纯度。当A260 nm/A280 nm接近1.80时，DNA纯度较高，当A260 nm/A280 nm1.80表明有蛋白等杂质，A260 nm/A280 nm接近2.00时表明RNA含量较高，DNA降解较多[9]。改良的CTAB法、SDS法、斑迹抽提法提取三裂叶豚草叶片基因组DNA的A260 nm/A280 nm分别为1.82、1.78和1.96（表1）。结果表明，改良的CTAB法提取的基因组DNA纯度较高；SDS法提取的DNA含有较多蛋白等杂质；斑迹抽提法提取的DNA降解严重。在抽提液颜色和DNA颜色上，改良的CTAB法抽提液为绿色，沉淀后的DNA呈白色，表明此方法去