杆状病毒表达系统杆状病毒滴度测定全攻略讲解.ppt

微量中和实验技术 PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞不出现CPE 谢谢 注意事项： 待检血清需56℃灭活30分钟。 需重复测定抗体时，血清应分装后冻存，以免反复冻融。 细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化，细胞 活力≥ 95%。 4. 牛血清有中和病毒感染力的作用，实验过程中切勿将细胞 培养液与病毒稀释液混淆使用。 5. 病毒与抗血清混合，常规采用37℃作用1小时。但针对不 同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。 6. 每份血清做3个生物学重复。 细胞免疫的检测 首先要完成淋巴的分离和体外刺激 包括脾淋巴细胞/外周血单核细胞的分离 脾细胞的分离： 2.将脾脏转入匀浆器中，加少量不完全1640，轻轻研磨。 1.处死的小鼠经消毒后，放置于泡沫板右侧卧固定，剪开左侧背腹交界处皮肤，分三套镊子/剪刀无菌取脾脏 3.静置，吸上清液入15 ml离心管中，1000rpm×10 min。 4.弃上清，加入5 ml的8.3g/l NH4Cl，静止5 min (去除红细 胞)，1000 rpm ×10 min。 5.弃上清，用不完全RPMI-1640洗涤，1000 rpm ×10 min。 6. 细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95%以上。 7.调整浓度为4×106 cells/ml。 * * 杆状病毒表达系统 疫苗实验体液免疫与细胞免疫的检测 杆状病毒表达系统 昆虫细胞的培养 重组pFastBac质粒的构建 重组Bacmid的产生与鉴定 获得重组杆状病毒 蛋白表达病毒扩大 Overview Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。 供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒 Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理 Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理 Expermiantal outline Insect Cell Lines： Sf9 or Sf21 cells ——主要用于转染，空斑实验和滴度测定 High Five? cells or Mimic? Sf9 cells ——转染效率低，主要用于蛋白表达 Graces Insect Medium with L-glutamine and supplemented with（pH 6.5）： 3330 mg/L lactalbumin hydrolysate3330 mg/L yeastolate 350 mg/L NaHCO310% heat-inactivated fetal bovine serum 昆虫细胞的培养 Atmosphere：air, 100% pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand Temperature：27.0—28.0 ℃ Subculturing： Preservation： 90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。 昆虫细胞的培养 重组pFastBac质粒的构建 选择合适的载体 重组Bacmid的产生 重组Bacmid的鉴定 PCR法: pUC/M13 Forward and Reverse primer 或者pUC/M13 Forward or Reverse primer and a primer that hybridizes within your insert Bacmid DNA ≥135kb 获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells 1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin? ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化 细胞变大 增殖明显变慢或不增殖 裂解 脱落 融合(VSV/G) 或 4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃ 病毒扩增蛋白表达 扩增病毒：接毒量为 0.05—0.1 MOI 一般情况下，P1代毒滴度大概为1×106 — 1×107 PFU/ml， P2 代毒滴度1×107—1×108 PFU/ml 比如：P1代毒滴度为5×106 PFU/ml，T75细胞瓶的细胞量 2×107cells，那么