从异源表达的环境DA中分离长链的N.docVIP

从异源表达的环境DNA中分离长链的N-酰基氨基酸 Sean F. Brady and Jon Clardy* 化学与化学生物系 纽约 伊萨卡 康奈尔大学14853-1301 2000年8月11 容易被标准培养技术培养的极少数的土壤微生物,大约有0.1至1.0％,创了一批阵容强大的生物活性物质,而未被培养的绝大多数可能产生具有化学多样性和生物活性的自然物质,就像被培养的微生物一样,要增加生产天然物质的未培养微生物,从土壤样品中直接提取的粘粒库DNA(环境DNA,eDNA)被用于构造和筛选具有生物活性的小分子物质。一个活性的粘粒克隆体，CSL12，产生了一系列长链的N-酰基-L-酪氨酸抗生素N-酰基氨基酸CSL12克隆的eDNA的分析表明ORF）负责N-酰基氨基酸N-酰基氨基酸eDNA库LB平板30°C下培育2-4天50微克/毫升）700000克隆筛选，65抗菌中CSL12，被选作进一步鉴定。LB（30微克/毫升，卡那霉素）0.1％醋酸 反相的LC-CN柱，然后再分区0.1％CSL12-A通过CSL12-M的反相分离3.5 KB BAMH CSL12的亚克隆，CSL12.1 亚克隆用于其余的表征研究。 CSL12-A的质量频谱分析是通过CSL12-M表明他们是一个家族的酪氨酸长链饱和及不饱和酰基衍生物，1—13. 酪氨酸明显是从观察的LRESI质谱碎片m / z为182和136）和1）酰基侧链。1-13在茚三酮显色法下均显示阴性表明酰基取代基通过酰胺键与氮相连。 12904 J. Am. Chem. Soc., Vol. 122, No. 51, 2000 图1：基因组启动系统（GPS）转座子诱变CSL12.1。转座子插入淘汰，减少或不影响抗菌活性；CSL12.1生产标有红色，黄色或绿色标志，分别为：(a) 从CSL12插入13.5 kb (b) 含有ORF1基因的预测启动的扩大区域(c) 在酪氨酸上拟议的符合相应的eDNA核糖体结合位点（RBS），-35和-10共识序列的大肠杆菌。 N-酰基酪氨酸的结构和配置，在这一系列的化合物中酪氨酸最终被证实由全合成生成的两个代表性的例子：-C的CSL12（3），最丰富的化合物从CSL12.1分离，CSL12 - G（7），从CSL12.1.5两个3和7隔离最活跃的化合物之一是光谱相同，其N-癸合成同行-L-酪氨酸和N-豆蔻-L-酪氨酸。 N-酰基酪氨酸 的结构和配置,在这一系列的化合物酪氨酸最终被 证实由醛合成的两个代表性的例子: -C 的 CSL12 (3), 最丰富的化合物 CSL12.1 分离, CSL12 - G (7), 从 CSL12.1.5 两个 3 和 7提取最活跃的化合物 之一是光谱相同, qí N –癸合成同行 -L-酪氨酸和N-豆蔻-L-酪氨酸, CSL12-CSL12-M型（1-13）显示出不同程度的抗菌活性，酪氨酸长度显著影响这些天然产物的抗菌活性与脂肪替代。在对枯草杆菌检测中，C13至C16的饱和和不饱和N-酰基取代L - 酪氨酸是最活跃的。侧链和两个碳或长或短的酪氨酸衍生工具明显不活跃，甚至更短的侧链衍生物，基本上是无活性的的。 CSL12.1基因系统的组转座子突变插入（New England Biolabs公司，马萨诸塞州）表明，测序一个单一的开放骨架（ORF1基因）的产生所观测到的抗菌活性，并允许CSL12.1插入，有两个例外：已发现的转座子插入淘汰生产抗菌活性的ORF1 （图1A），剩下的是两个插入ORF1基因的eDNA中的内源性启动子（图1B）除了座子完全淘汰的抗菌活性，我们还发现了一个影响启动子上端和下端，但在ORF1基因组插入后在琼脂平板实验中观察到的抗菌活性降低（图1b）。转座子插入的研究表明，ORF1基因的eDNA包含它自己的启动成功用于大肠杆菌的抗菌活性和负责的。在体外生化研究目前正在进行确认的ORF1是一个N-酰基转移和不能正常间接导致酪氨酸N-酰基化合物在大肠杆菌中宿主的生产。 增设3个假想的的ORF（150个氨基酸），目前在CSL12.1似乎并没有被组织为次生代谢产物基因簇，A BLAST的研究没有发现任何与这些ORFs的序列相似性沉积序列。A BLAST的研究从甲烷jannaschii，8（MJ1207）类似的ORF1中发现一个序列，一个假设的蛋白质，。 并假设其中的MJ1207的N-酰基转移，并认为尽管ORF1基因是这组序列的同源性唯一的远亲，其功能类似于转移N-酰基，生产的N-酰基产品可能具有显着的同源性序列。 长链的N-酰基aminoacylases已在细菌，微生物之中被广泛的鉴别出，然而这些化合物还尚未经过酶的催化测定，这种天然产品日益增长的家庭的作用仍不清楚。通过观察，这些长链的N-酰基氨基