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光谱技术 一、原理 激发与发射 （2）发光光谱 分子吸收了外来的电磁辐射以后，处于不稳定的激发状态，随即又以光发射的形式把能量放出来，这种现象称为光致发光 Photoluminescence 在次级光的发射过程中，当光源停止照射以后约10-5s 发光即消失，这种发光叫荧光 Fluorescence 。 当辐射光源虽已停止照射，发光分子仍能保持10-3- 10 s 或更长时间，此种发光成为磷光 Phosphorescence 。 荧光光谱的主要参量 激发谱和发射谱 激发谱与吸收光谱极为相似,呈正相关 激发态和基态有相似的振动能级分布，能级跃迁几率也相近．因此吸收谱与发射谱呈镜像对称关系。 在发射谱中最大荧光强度的位置称为?max，是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感 荧光寿命 去激发，荧光强度降到去激发 时刻光强I0的1/e所需要的时间? 3. 量子产率? quantum yield 表示物质发射荧光的效率 处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其他回到基态。其结果是加快了激发态分子回到基态的过程 或称退激过程 . 4. 荧光强度 荧光强度F 取决于激发态的初始分布IA与量子产率?A 的乘积。 F? IA?FZ 2.3I0? ?A Cl ?FZ 荧光强度与样品在波长?A处的消光系数? 有关，而? 与激发波长是密切相关的， ? 随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。 实际上，仪器因子z与波长是有关的，导致激发谱与吸收谱并不完全相似。 5. 极化率 偏振度 用平面偏振光去激发一个荧光系统，可以产生偏振荧光。可以通过对偏振荧光的分析确定分子的大小、形状和流动性等性质。偏振荧光分析在生物研究中已成为一种有力的研究手段。 定义极化率为 6. 荧光生色团和荧光探针 荧光生色团特征： 1 碳原子骨架：具有共轭双键体系的分子容易产生荧光。绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环。任何有利于?电子共轭度的结构变化都将提高荧光效率，或使荧光波长红移。 2 分子的几何排布：具有刚性平面结构的有机分子容易发荧光。平面构型或分子刚性增加，荧光增强。 3 取代基的类型和位置。 4 环境、溶剂、温度、pH等均会影响分子结构，从而影响荧光。 荧光探针 1 能产生稳定的、较强的荧光； 2 探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合的比较牢固 3 探针的荧光必须对环境条件较敏感； 4 结合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。 荧光探针种类很多，要根据需要合成新的探针 内源荧光技术：生物分子内部本身的荧光生色团发出的荧光进行荧光研究的技术 外源荧光技术：利用荧光探针标记生物分子来进行荧光研究的技术。 （3）拉曼光谱 样品分子处于电子能级和振动能级的基态，入射光子的能量远大于振动能级跃迁所需要的能量，但又不足以将分子激发到电子能级激发态。这样，样品分子吸收光子后到达一种准激发状态-虚能态。样品分子在准激发态时是不稳定的，它将回到电子能级的基态中的各振动能级 如果样品分子回到较高振动能级，则散射的光子能量小于入射光子的能量，称为stokes线。如果样品分子在与入射光子作用前的瞬间不是处于电子能级基态的最低振动能级，而是处于电子能级基态中的某个振动能级激发态，则该分子退激回到电子能级基态的振动能级基态，称为反stokes线。两线位于瑞利谱线两鹰，间距相等 如果分子的振动引起分子极化率的改变，则分子具有拉曼活性 拉曼位移（Raman shift） CCl4的拉曼光谱 共振拉曼光谱RRS 拉曼光谱与红外光谱的关系 拉曼光谱与红外光谱的关系 共振拉曼光谱RRS （4）光声光谱（Photoacoustic Spectroscopy，PAS） 当物质吸收光受到激发后，返回初始态可通过辐射跃迁或无辐射跃迁。前一过程产生荧光或磷光，后一过程则产生热。 假如吸收光的强度呈周期性变化，密闭容器内热的生成呈周期性变化，容器内压力涨落也呈周期性，由于调制光的频率一般位于声频范围内，所以这种压力涨落就成为声波，从而被声敏元件所感知。 二、光谱分析技术 荧光共振能量转移 如果两种不同的荧光生色团离得较近，且其中一种生色团的荧光发射谱与另一种生色团的激发谱有相当程度的重登，则当第一种荧光团被激发时，另一种荧光团会因第一种生色团激发能的转移而被激发。 转移效率T与两种生色团之间的距离R之间关系： 供体与受体之间的共振能量转移 分子荧光分析技术 二维荧光光谱法 三维荧光光谱法 同步荧光光谱法 时间分辨荧光法 荧光动力学分析法 FLS920 Steady State and Time ResolvedFluorescence Spectrometers FLS920 Steady State an