分子信标.doc

1?简介 　　分子信标（molecular beacon）是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。并且不会产生荧光。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。 　　分子信标的茎环结构中，环一般为15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。荧光强度与溶液中模板的量呈正比。所以可以用与PCR定量分析。由于是酶切作用的存在，分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM ，Texas Red 。 　　特点：采用非荧光染料作为淬灭分子，所以荧光本底低。 　　不足：杂交时探针不能肯定完全与模板结合，所以稳定性差，、 　　探针合成时标记较复杂 　　分子信标技术结合不同于荧光标记，可用于基因多突变位点同时分析 　　和结核杆菌耐药基因rpoB的耐药分析不足 2 分子信标的设计一般包括三个部分： 　　（1）环状区：一般为长度15～30碱基的序列，能与目标分子特异结合； 　　（2）信标茎干区：通常为长度5～8 个碱基的互补序列，茎干区与杂交后环状区- 　　目标分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的 　　线状探针； 　　（3）荧光基团和淬灭基团，荧光基团一般联接在信标分子的5 端；淬灭基团联接 　　在3’端。图1 为经典的分子信标结构，其中1—氨基萘—8—羧酸 EDANS 为荧光素, 　　二甲氨基偶氮苯甲酰 DABSYL 为淬灭剂。分子信标中常用4— 4’— 二甲基氨基偶氮 　　苯基 苯甲酸 DABCYL 作为淬灭基团，德克萨斯红 TexasRed 、荧光素 Fluoresein 等作 　　为荧光基团。 3 自由状态时，发夹结构的两个末端，使荧光分子与猝灭分子靠近 约为7—10nm 。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。，当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分 　　子和猝灭分子距离增大。根据Foerster 理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。 4 （1）核酸检测分析 　　（2）分子信标用于研究DNA—蛋白质的相互作用 　　（3）分子信标用作生物芯片和生物传感器的探针 5 近年来,分子信标因具有灵敏度高,特异结合性好等优点而被广泛应用于生物学和生 　　物分析领域。在注重功能基因研究的后基因组时期,分子信标将会被更多地应用于基因突 　　变引起的疾病的研究、活细胞中RNA 的检测、蛋白质的检测及生物芯片研究等。随着 　　分子信标技术的发展和新型分子信标的不断出现,分子信标将会在基因诊断、基因治疗以 　　及新药的研制开发等方面得到越来越广泛的应用。 实时荧光定量PCR原理