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生物化学实验九定糖法测定RNA含量
实验九 定糖法测定RNA含量
一、目的要求
掌握苔黑酚显色法测定RNA含量的原理和操作方法。
二、实验原理
RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应形成绿色复合物，该产物在670nm处有最大吸收。当RNA浓度为20～250μg/ml时，吸光度与RNA的浓度成正比。
苔黑酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，DNA及其他杂质也有影响。故一般测定RNA时，可先测定样品中DNA含量，再算出RNA含量?。
三、材料、器材与试剂
1〉材料
未知浓度核酸溶液。
2〉器材
试管、试管架、吸管、洗耳球、水浴锅、分光光度计。
3〉试剂
1 RNA标准液：称取10mg RNA 需先定磷确定其纯度 用少量蒸馏水溶解 若不溶可用2mol/l NaOH溶液调至pH7.0 。定溶至100ml，浓度为100μg/ml。
2 样品液：准确称取核糖核酸样品10mg，用蒸馏水溶解并定容至200ml，每1ml溶液含RNA干品50μg。
3 苔黑酚试剂：取0.1g苔黑酚溶于100ml浓盐酸，再加入0.1g FeCl3·6H2O。该溶剂需使用前新鲜配制。
四、实验步骤
1〉RNA标准曲线制作
取干试管6支，按表加入试剂。 上述试剂加完后，充分混匀，于沸水浴中加热20min，取出置自来水中冷却，以0号管为空白，于670nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，RNA量浓度为横坐标作图，绘制标准曲线。
2〉样品测定
另取试管1支，为样品管，加入1ml样品液，再加3ml苔黑酚试剂，混匀，置沸水浴中加热20min，取出冷却。670nm处测其吸光度。
五、结果处理
根据样品的吸光度值从标准曲线上查出相应的RNA含量。根据下式计算出样品中RNA的百分含量。
RNA % 样品液中测得的RNA微克数/样品液中样品的微克数 ×100%
实验结果：
RNA % 36.1/50×100% 72.2%
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