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转氨基实验报告 - 实验报告 - 书业网 篇一：实验六 纸层析法观察转氨基作用 实验报告 实验六 纸层析法观察转氨基作用 【实验名称】：纸层析法观察转氨基作用 09救援一班 第三大组 李岚宇 2009222336 室温：28° （一）实验目的： 1、学习氨基酸纸层析的基本原理。 2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。 （二）实验原理： 转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应： α—酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示： ????ALT 物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。 （三）实验材料与仪器： 试剂： 1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。 2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。 3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔 细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。 4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。 5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。 7、层析溶剂：将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。 仪器：玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。 （四）实验步骤: 1、肝匀浆制备：取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆， 用上述缓冲液4.5ml混匀备用。 2、 酶促反应过程 （1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。 （2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液 1.5 ml,摇匀。 （3）37保温，30分钟后取出，保温完毕。 （4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。 3、层析 （1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。 （2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。 （3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。 （4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。 （5）显色：将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算