Process NGS data in QIIME.pptx

二代测序数据在QIIME中的 处理 ——以Illumina Miseq平台为例 时玉 2017-3-31 QIIME (Quantitative Insights Into Microbial Ecology) ，音同”Chime”，是一个用于比较和分析微生物群落的开源软件，其开发者是美国科罗拉多大学的Rob Knight等人。QIIME能够处理的标准数据是各种测序平台上扩增子的高通量测序结果。至今为止，QIIME已经被2229篇文献引用。 QIIME是什么 提纲（based on QIIME 1.8.0） 1、安装QIIME 2、认识Illumina Miseq数据 3、Miseq原始数据的处理 4、下游分析 QIIME for windows 1、下载Windows版本的Virtual Box 3、打开Virtual Box，新建一个虚拟设备 4、进入Ubuntu系统后，看见集成了QIIME的系统界面 2、至QIIME网站上下载”64-bit QIIME Virtual Box” (/install/virtual_box.html)，解压该文件 QIIME for windows 5、打开Before_you_start文件夹，按文件顺序依次阅读并安装必要软件 6、设置Shared_Folder 认识Miseq数据 Phred Quality Score Probability of incorrect base call Base call accuracy 10 1 in 10 90% 20 1 in 100 99% 30 1 in 1000 99.9% 40 1 in 10,000 99.99% 50 1 in 100,000 99.999% 60 1 in 1,000,000 99.9999% read ID read 序列 省略的read ID Phred score+33 拼接reads Miseq原始数据的处理 join_paired_ends.py -f forward_reads.fastq -r reverse_reads.fastq –j 10 –p 10 -o fastq-join_joined 将双向测序的reads通过overlap区域进行识别并组装成一条完整的序列，将生成拼接完毕的fastq文件，用于后续分析。 -j：指定最小的overlap长度 -p：指定overlap区域里正反reads不一致碱基所占比例的阈值 Miseq原始数据的处理 extract_barcodes.py -f inseqs.fastq -c barcode_single_end --bc1_len 7 -o processed_seqs 将序列文件中的barcode信息提取出来，生成一个fastq格式的barcode文件和去除了barcode的序列文件。 -c：barcode的布置方式 --bc1_len ：指定barcode长度 提取barcode Miseq原始数据的处理 map文件是txt格式的文本，提供了barcode、引物、样品编号、处理等信息，在后续的分析中将被频繁调用，是非常重要的标记文件。 validate_mapping_file.py -m Fasting_Map.txt -o validate_mapping_file_output 在QIIME中验证map文件的格式。将会生成一个html格式的文件，若格式并非完全正确，则打开该文件后将看到部分单元格呈黄色或红色，分别表示警告信息和错误信息。警告信息可以忽略，但须谨慎；错误信息必须改正，否则map文件不能被正确读取。 制作及验证map文件 Miseq原始数据的处理 split_libraries_fastq.py -i reads.fastq -b barcodes.fastq -m Map.txt -q19 -o split_libraries_fastq/ 依据barcode文件将每一条序列归类到不同的样品中去，生成的文件是一个归类完毕的fasta格式序列文件，其中所有序列都有唯一编号和所属样品。 -m：map文件 -q：指定碱基质量分数阈值 割库 下游分析 pick_otus.py -i seqs.fna -r refseqs.fasta -m uclust_ref -s 0.97 -o uclust_picked_otus 使用某种算法对序列进行聚类。生成的文件seqs_otus.txt，是一个otu ID和序列ID对应关系的map文件。 -r：指定参比的序列文件 -m：指定pick otu的方法(uclust, blast, usearch, mothur…) -s：指定一个otu内序列相似性的阈值 OTU聚类 下游分析 每个otu