BMP9 文献汇报.pptVIP

Function alanalysis of the BMP9 response of ALK1 mutants from HHT2 patients:a diagnostic tool for novel ACVRL1mutations VASCULAR BIOLOGY HHT（遗传性出血性毛细血管扩张） 由编码TGF-β受体家族的基因突变引发常染色体显性可遗传性血管发育异常。 突变分为主要有三种： 1.ENG:编码内皮糖蛋白（HHT1） 2.ACVRL1：编码激活素受体样激酶 1（HHT2） 3.MADH4：编码Smad4(少年息肉病和HHT) 1、2两种情况占据80%到90%， 实验出发点 ALK1属于1型受体能和配体直接结合促进Smad1和Smad5磷酸化来绝对信号的特殊性。 内皮糖蛋白因子属于2型受体没有激酶活性，能够增强配体和受体结合能力。其突变所引起的HHT1是单倍剂量不足。 细胞膜 ALK1 endoglin 实验出发点 BMP9被发现时ALK1的配体，并且存在于人血浆中，导致成人血管静止。（BMP10未被证明所以使用BMP9）BMP9配体的发现有利于重新考虑疾病背后的分子机制。 本实验的目的就是利用BMP9配体去评估ACVRL1突变的功能意义。可以去猜测HHT2是否单倍剂量不足。及区分致病突变及非致病突变。 实验方案 大体方案：产生19个ALK1突变体（15个之前描述过的和4个新奇的突变），这些突变分布在蛋白质的不同部位上。然后突变基因转染到细胞让其表达，观察突变的ALK1是否表达及测试与BMP9的结合能力及信号通路的检测。 实验操作方法 选用的细胞是NIH-3T3成纤维细胞和COS-7细胞，用DMEM培养（含10%胎牛血清） 突变DNA构建：ALK1突变体是通过聚合酶链式反应定点突变在pcDNA3质粒中的WT-ALK1。包括15个在患者中发现的突变。14个是错义突变，其中三个在胞外区域（C51Y,C77W和N96D），D179A位于GS区域，另外十个位于胞内区域（ A347P, R374W, R374Q, R411Q, R411W,R411P, R479Q, R484W, R484Q, and I485F ），还有一个是插入1-bp移码， （G371fsX391 ）导致过早的终止密码。另外四种突变在 病人中呈现矛盾的结果3个ACVRL1突变(L381P, A482V, and R454W)及一个ENG (R386C)突变，其中ENG突变的一个病人中发现同时还在ACVRL1同位基因上发现两个突变。 在这些突变中(L381P, R386C, R454W, and I485F)先前并没有报道与HHT2相关。 所有的突变体都在C末端加HA标签，有些还在C末端加上6个组氨酸标签或者在N末端加上HA标签。（为了检测其表达情况） 报告基因构建： pGL3(BRE)2-luc质粒植入细胞表达虫荧光素酶检测反应BMP反应，pRL-TK-luc 质粒植入细胞表达水母荧光素酶检测反应胸腺嘧啶激酶启动子。 DNA转染和双荧光素酶活性测定 免疫沉淀和WB分析 流式细胞分析ALK1表达 BMP9放射性受体分析 结果 1.分析突变是否影响蛋白的表达，利用碳末端添加标签，加入抗体免疫印迹。发现除G371fsX391外其他与野生型没有太大区别。因为这个突变致使其没有C末端HA标签 2.分析影响蛋白质表达场所 利用流式细胞仪，添加抗ALK-1多克隆抗体。空白组没有ALK-1的表达。 除了三个（C51Y,C77W,N96D）外其他和野生型表达情况差不多，包括前面提到的G371fsX391。 为了辨别上述三个突变，细胞外突变的蛋白是否表达在细胞外或是构象发生变化和抗原没法结合。在N末端加上了HA标签。再利用FACS和抗HA抗体测量其表达情况。 得到的结果是C77W部分表达在细胞表面，C51Y和N96D基本不在细胞表面表达。 评价功能活性 利用WB分析Smad1/5磷酸化来分析ALK-1对BMP9的反应的活性情况。除野生型和D179A突变能使其磷酸化，其余不行。D179A位于GS区域 利用荧光素酶报告基因来评价磷酸化情况以拿来分析BMP9的反应情况。与上述WB分析得出差不多的结论。除D179A和野生型能磷酸化，其余不能。侧面反应只有两者能BMP9反应 为了确定突变是起否显形作用 加入的ALK1突变体对BMP反应没有显形抑制作用。当然D179A和野生型表现差不多。 突变是否会影响受体与配体BMP9的结合 标有[125I]的BMP9与突变型细胞放在4℃2小时。然后利用放射性检测是否与细胞结合。结论：除细胞外突变和G371fsX391未能与BMP9结合，其余和野生型差不多。 Novel突变分析 结论 1.大多数突变蛋白表达在